火球菌RecJ蛋白的表达纯化及结晶.pdf

第36 卷 第8 期 核 技 术 Vol. 36, No.8 2013 年8 月 NUCLEAR TECHNIQUES August 2013 火球菌 RecJ 蛋白的表达纯化及结晶 杨 敏 李敏军 周 欢 陈亚星 孙丽华 郁 峰 徐春艳 唐 琳 何建华 （中国科学院上海应用物理研究所张江园区 上海 201204 ） 摘要 RecJ 蛋白是一类在细菌和古菌中高度保守的蛋白，在细胞内参与同源重组、甲基指导的碱基错配修复 和碱基切除修复等过程。RecJ 蛋白除了可以从单链DNA 的5端降解DNA 外，还可以从单链RNA 的3端降 解 RNA 。为能够从结构上阐明古菌火球菌(Pyrococcus furiosus) RecJ 蛋白在细胞内的功能和其对不同底物 (RNA/DNA) 的降解活性的影响，本实验采用蛋白质晶体学的方法，通过蛋白质的表达纯化，晶体筛选得到了 火球菌RecJ 蛋白的晶体，并通过结晶条件的初步优化得到了有衍射的晶体。 关键词 RecJ 蛋白，蛋白质表达纯化，晶体筛选，X 射线衍射 中图分类号 TL71 DOI: 10.11889/j.0253-3219.2013.hjs.36.080103 为保证基因组的稳定性，所有细胞都需具备 负责3端错配RNA 引物的校正。 DNA 修复和重组系统。其中一些 DNA 外切酶在 虽然很多课题组广泛而深入地开展了 RecJ 蛋 DNA 修复和重组系统中发挥着重要作用[1,2] ，如 白的功能研究，并基于该蛋白的生化特性研究对其 [3] RecJ 蛋白。在同源重组、碱基切除修复(BER) 、 功能进行了阐述，但到目前为止，仅嗜热细菌 甲基指导的碱基错配修复(MMR)等过程中[4,5]，RecJ (Thermus thermophilus)RecJ 蛋白(ttRecJ)的结构得到 能够特异地从5−3端降解单链DNA 。 了解析。Taisuke Wakamatsu 等[10]通过嗜热菌 RecJ 1984 年，Lovett 及其同事发现 RecJ 基因在同 蛋白晶体结构的解析，从结构的角度解释了 RecJ 源重组的 RecF 通路中是必不可少的，该基因编码 能够特异地从5端降解单链DNA ，同时，Yamagata 的蛋白通过解旋酶RecQ 降解DNA 双链缺口处的松 等[11]还解析了该蛋白与金属锰离子复合物的结构， 散DNA ，在其中一条DNA 链上产生3端尾巴，从 阐明了Mn2+对RecJ 外切酶活性的重要性。 而启动重组过程。当复制叉发生DNA 损伤时，RecJ 鉴于RecJ 蛋白在细胞中发挥的重要功能，除获 还能够和 RecQ 协同作用降解复制叉上的后随链， 得的ttRecJ 蛋白质结构外，还需对其它菌种的RecJ 从而阻断DNA 复制。DNA 损伤一旦被修复，RecF 开展更多的结构生物学研究，从而获得更清晰的结 蛋白将启动DNA 的重新复制。除了RecJ 蛋白，其 构−功能关系。本课题采用与嗜热菌 RecJ 蛋白 它任何解旋酶都不具有阻断DNA 复制的功能[6] 。此 (ttRecJ PDB，编码为：2ZXO)有较低序列相似性的 外，在BER 过程中，RecJ 蛋白通过去除5-端的2- 火球菌的RecJ 蛋白(P.fu RecJ)开展RecJ 的结构功能