苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30的纯化与性质研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６ｓ）：１０７～１１１ 苦瓜籽核糖体失活蛋白ＭＡＰ３０的 纯化与性质研究 包凌晟　钱正旭　魏　波　张永明　孟延发 （四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室　成都　６１００６４） 摘要　采用丙酮分级沉淀、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５层析和 ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ层析，从苦瓜籽中获得核糖 ? 体失活蛋白ＭＡＰ３０。纯化的ＭＡＰ３０经ＰＡＧＥ、ＳＤＳＰＡＧＥ、ＩＥＦ和ＰｅｒｉｏｄａｔｅＳｃｈｉｆｆ分析均为单一蛋 ? ? 白着色带或单一糖蛋白着色带，根据ＳＤＳＰＡＧＥ计算其相对分子量为３０ｋＤａ，经ＩＥＦＰＡＧＥ计算其 ? ? ｐＩ为９．０，采用硫酸苯酚法测得其含糖量为１．０５％。Ｎ端测序结果为ＡｓｐＶａｌＡｓｎＰｈｅＡｓｐＬｅｕ ? ? ? ? ? ? ? Ｓｅｒ。光谱学研究表明：最大紫外吸收峰为２８０ｎｍ，以２７８ｎｍ波长光激发时，该蛋白具有３０４ｎｍ荧 ? 光发射峰和３１６ｎｍ副峰，以２９５ｎｍ波长光激发时，该蛋白的最大荧光发射峰在３１７ｎｍ。体外试验 表明其对小鼠黑色素细胞瘤Ｂ１６细胞具有明显抑制作用，而对完整细胞毒性极小。 关键词　苦瓜籽　核糖体失活蛋白（ＭＡＰ３０）　荧光光谱 中图分类号　５６４２．５０１；Ｑ７８ 　　核糖体失活蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）是 ３０ｋＤａ的蛋白质，属于Ｉ型核糖体失活蛋白，在理论和 广泛存在于植物界的一类蛋白毒素，它能够对核糖体 应用开发上都具有重要的价值。在理论研究上，它可 大亚基上２８ｓｒＲＮＡ进行脱腺嘌呤作用，从而破坏核糖 以作为研究核糖体ＲＮＡ结构与功能的工具酶；在应用 体结构，抑制蛋白质的生物合成。根据 ＲＩＰ一级结构 开发上，将苦瓜籽核糖体失活蛋白与单抗耦联后形成 的不同，可将其分为两种类型。 Ⅰ型 ＲＩＰ由一条多肽 “免疫毒素”，可准确地导入肿瘤细胞，从而高效地杀伤 链组成，分子量在３０ｋＤａ左右，一般为碱性糖蛋白，等 ［６］ 靶细胞 。本文在前人工作的基础上，改进提取工艺， 电点在８～１０之间，少数在１０以上，具有ＲＮＡＮ糖苷 ? 获得了核糖体失活蛋白，且对其理化性质进行了分析， 酶活性。 型ＲＩＰ分子量大约为６０ｋＤａ，由分子量相近 Ⅱ 并测定了它对完整细胞的毒性以及对一些肿瘤细胞的 的Ａ、Ｂ两条多肽链通过一对二硫键相连，并通过强烈 抑制作用，为苦瓜籽核糖体失活蛋白的进一步研究奠 的疏水作用结合在一起，等电点在６～８之间。其中Ａ 定了基础。 链和 型ＲＩＰ一样具有ＲＮＡＮ糖苷酶活性；Ｂ链是一 Ⅰ ? 个对半乳糖专一的凝集素，能介导Ａ链进入细胞发挥 １　材料与方法 作用。 １．１　材　料 　　苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ）系葫芦科一年生草本 １．１．１　细胞与培养基　小鼠黑色素细胞瘤Ｂ１６细胞、