电泳的原理.pdf

知识介绍 电泳的原理、应用及进展 下（） 蔡仕英 姚志建 军（事医学科学院基础医学研究所，北京，100850） 三、核酸电泳 以通常在胶中加入 7或8mol/L的尿素并保持电泳 核酸包（括DNA和RNA）是一类带负电荷的生 时胶内温度在55-65 ，以防止DNA形成二级结构 物大分子，在电场作用下可由负极向正极移动，因此 而影响电泳结果。DNA序列分析电泳的聚丙烯酰胺 可用电泳的方法进行分离、鉴定和纯化。核酸电泳根 凝胶浓度为6-8％ィ，胶厚为0.1－0.5mm，胶长为35 据所用凝胶介质的不同可以分两类，即琼脂糖凝胶 －100cm。序列分析电泳时采用薄胶胶（厚 0.2mm 电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖电泳几乎都在 具有许多优点，如 1在高电场强度下可进行快速分 水平板上进行，操作简单，快速有效；聚丙烯酰胺电 离；2干燥成薄膜可缩短曝光时间；3减少辐射线的 泳多在垂直板中进行，主要用于某些特殊需要，如 散射，可获得更高的放射自显影分辨率；4样品用量 DNA序列分析电泳、寡核苷酸的分离鉴定。根据外 减少。至于胶的长度，一般说来胶越长分辨效果越 加电场的不同，核酸电泳又分为恒定电场的常规电 好，但胶过长不便操作，所以在序列分析电泳中，引 泳和脉冲场电泳。 用了楔形胶，即胶底比胶顶厚厚（度比为2-4，这样 一（）恒场常规核酸电泳 一来，一定的电流通过时，流过胶底单位横截面的电 恒场常规核酸电泳是基于分子筛效应的凝胶 电 流要比胶顶的小，即小片段DNA在胶底迁移得比在 泳，像蛋白质的SDS一样，核酸的迁移率与其 胶顶慢，这样在小片段DNA不走出胶的条件下大片 分子大小的对数成反比。在恒场常规核酸电泳中影 段DNA能有更长的时间电泳，从而在不增加胶长的 响电泳迁移率有四个主要参数：1核酸分子的大小： 前提下可以提高电泳分辨率，读出更多的序列结构， 这是由分离、鉴定对象本身决定的。2凝胶浓度：凝 解决了在序列分析电泳中遇到的小片段DNA走得 胶浓度不同，核酸迁移率也不同，有效分辨的线性 快、分得开而大片段DNA走得慢、分不开的问题。 DNA大小范围也不同，表34分别列出了不同浓度 表3 琼脂糖凝胶浓度与核酸有效分辨范围的关系 的琼脂糖及丙烯酰胺凝胶的有效分辨范围。一般说 来，分离鉴定小于1000个核苷酸的核酸片段可用聚 丙烯酰胺电泳，分离鉴定0.1-50kb的DNA片段 可用恒场常规琼脂糖电泳，而分离鉴定大于50kb的 DNA片段则需采用脉冲场琼脂糖电泳。3DNA的 构象：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，相同分子量的 DNA分子，闭环超螺旋形式迁移得最快，其次是线 性形式，开环形式最慢。在核酸序列分析电泳中，核 酸的二级结构也影响其电泳迁移率。4电流强度：在 低电压下，琼脂糖电泳中的线性DNA分子的迁移率 表4 丙烯酰胺胶浓度与核酸有效分辨范围的关系 与所加电压成正比，随着电压的提高，分子迁移率不 同程度地增大，但有效分辩范围却减小，因此要得到 最大分离效果，琼脂糖电泳应在不大于5V/cm的电 场中进行。此外，温度及核酸的碱基组成对电泳结果 也有一定影响。 需要指出的是DNA序列分析电泳都在高电压 二（）核酸的脉冲场电泳 大（于1000V）下进行，DNA必须维持在变性状态，所 前面我们已经提到，分子筛效应的恒场常规凝 胶电泳能很好地分离、鉴定小于20kb的DNA分子， lsedhomogenousorthogonalfieldgelelectrophoresis, 而对大于50kb的DNA分子则很难进行分离、鉴定， 简称PHOGE。目前这方面的技术进展很快，最高分 这是因为DNA分子在凝胶介质中显无规卷曲构象。 辨能力已达10Mb。 当DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，卷曲的 脉冲凝胶电泳技术在单细胞真核生物及人类遗 DNA分子在电场作用下会沿电场方向拉伸变形挤 传学等研究中有着广泛应用。利用这一技术可以对 过筛孔，此时凝胶介质的分子筛效应不明显DNA 单细胞真核生物的核型进行分析，以显示出