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超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷
中国农业科学 2017,50(16):3196-3204
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.014
超表达苹果细胞分裂素响应基因 MdCRF6 影响
花青苷积累和盐胁迫抗性
1 2 2 1 1 1
安建平 ,宋来庆 ,赵玲玲 ,由春香 ,王小非 ,郝玉金
1 2
(山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室,山东泰安 271018 ; 烟台市农业科学研究院,山东烟台 265599 )
摘要:【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF6 (cytokinin response factor 6),鉴定其在调节
花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用,揭示 MdCRF6 的功能,为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理
论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果(
Malus domestica ‘Gala’)为研究材料,利用同源序列比对和 PCR 技术,分
离细胞分裂素响应基因 MdCRF6。使用 MEGA 5.0 软件构建苹果 MdCRF6 与拟南芥 CRFs 间系统进化树;通过 SMART
软件和 DNAMAN 软件分析 MdCRF6 蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量 PCR 方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁
迫的响应。通过电泳迁移率试验(EMSA),验证MdCRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建MdCRF6 植物超
表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得转 MdCRF6 苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青
苷积累和盐抗性方面的差异,结合基因表达分析,初步鉴定 MdCRF6 在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。
【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因 MdCRF6(基因序列号:MDP0000783818),该基因开放阅读框(ORF)
为 1 047 bp,编码含有 348 个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明,苹果 MdCRF6 蛋白在 N 端
包含保守的 CRF 结构域,在 C 端包含保守的 AP2/ERF 结构域,并且与拟南芥 AtCRF6 同源性最高。基因表达分析
显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应,分别在 10 μmol·L-1 -1
BA 和 100 mmol·L NaCl 处理 3 h 和 6 h 时表达
量最高。EMSA 试验结果验证 MdCRF6 原核表达蛋白能够绑定 DRE 序列。在苹果愈伤组织中超表达 MdCRF6,发现
MdCRF6 转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制,同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示,MdCRF6
显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果 MdCRF6 与拟南芥 AtCRF6 具有高度的同源性,
其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达 MdCRF6 抑制其花青苷积累,降低植物抗
盐性。推测苹果 MdCRF6 可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子,抑制基因的表达,从而负调
节花青苷积累和抗盐性。
关键词:苹果;MdCRF6;花青苷;盐胁迫
Effects of Overexpression of Apple Cytokinin Response Factor Gene
MdCRF6 on Anthocyanins Accumulation and Salt Stress T
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