鲫鱼鳃中迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定.pdfVIP

— ２２０— 江苏农业科学　２０１３年第４１卷第５期 王　艺，李槿年，兰　云，等．鲫鱼鳃中迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（５）：２２０－２２１． 鲫鱼鳃中迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定 １ １ １ ２ ２ ２ ２ 王　艺 ，李槿年 ，兰　云 ，胡秀彩 ，沈晓静 ，李　雪 ，吕爱军 （１．安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥２３００３６；２．江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州２２１１１６） 　　摘要：以市售鲫鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）为研究对象，从鳃中分离获得一株细菌，编号为Ｅｔ－１，通过细菌形态学观 察、理化特征鉴定、１６ＳｒＤＮＡ克隆测序及系统发育进化树构建等方法进行系统鉴定，结果表明Ｅｔ－１菌株为革兰阴性 杆菌，进一步ＰＣＲ扩增Ｅｔ－１菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列为１５０８ｂｐ；系统进化树分析表明，Ｅｔ－１菌株与迟钝爱德华氏菌 （Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｔａｒｄａ）亲缘关系最近，自然聚为一支，序列同源性达９８．７％～１００％，最终确定Ｅｔ－１为迟钝爱德华氏菌。 　　关键词：鲫鱼；鳃；迟钝爱德华氏菌；分离鉴定；ＤＮＡ测序 　　中图分类号：Ｓ９１７．１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１３）０５－０２２０－０２ 　　鲫鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）是一种杂食性鱼类，也是水产养 １．１　材料 殖的优质鱼类。细菌性疾病是造成鲫鱼生产乃至水产业严重 鲫鱼（０．２～０．３ｋｇ）购自徐州市某菜市场，迅速带回实验 ［１］ 室备用。ＬＢ培养基、ＳＳ琼脂培养基、细菌微量生化鉴定管及 损失的重要疾病之一 。爱德华氏菌属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）细菌 常引起鱼类的败血症，主要包括迟钝爱德华氏菌（Ｅ．ｔａｒｄａ）、 三糖铁（ＴＳＩ）培养基等购自杭州微生物试剂有限公司。细菌 爱德华氏菌（Ｅ．ｉｃｔａｌｕｒｉ）和保科爱德华氏菌（Ｅ．ｈｏｓｈｉ 基因组提取试剂盒、ＤＮＡ胶回收试剂盒、ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ等购 ［２］ 自上海生工生物工程公司，ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ试剂盒购自 ｎａｅ） 。邓先余等从患红头病的黄颡鱼（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓｆｕｌ ｖｉｄｒａｃｏ）、患腹水病的牙鲆（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ）体内分离获 ＴａＫａＲａ公司。 ［３－４］ １．２　方法 得了迟钝爱德华氏菌病原菌 。迟钝爱德华氏菌是爱德华 氏菌属的模式种，宿主十分广泛，是感染淡水鱼和海水鱼的主 １．２．１　细菌分离、形态观察与生化试验　参照胡秀彩等的方 ［７］ 要病原菌之一。此外，迟钝爱德华氏菌是爱德华菌属中唯一 法 进行，将纯化细菌分别接种于１９种微量发酵管中，２９℃ ［５］ 培养２４～４８ｈ，观察细菌的生理生化反应。 的人畜共患病病原菌 。 近几年来，鱼类微生态学成为了国内外学者研究的热点 １．２．２　细菌总ＤＮＡ提取、１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ扩增及系统发育树 ［６－７］ 分析　采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌总ＤＮＡ，琼脂糖 之一，尤其在鱼类肠道细菌研究方面取得了一定的进展 。 但是，目前关于鱼类鳃中细菌分布的研究还不够深入，国内外 凝胶电泳检测后保存于 －２０℃备用。ＰＣＲ扩增反应体系 ［５，８］ （２５ Ｌ）：ＤＮＡ模版１ Ｌ，上游引物（２７Ｆ：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴ 文献鲜有报道 。最近，陈强等采用 １６ＳｒＤＮＡ测序等方法 μ μ Ｇ