基因工程与体外表达.ppt

杆状病毒表达系统利用一种不依赖于辅助病毒的病毒,该病毒可在适于悬浮培养的昆虫细胞中增殖至高滴度,能获得大量的重组蛋白,大部分超量表达的蛋白质为可溶性蛋白.杆状病毒对脊椎动物无感染性。 （二）药物筛选转染细胞 哺乳动物细胞中最常用的选择性标记物中包括有细菌新霉素抗性基因（neor）。此基因具有对氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）的抗性。G-418是用于阻断细胞内的蛋白质合成，从而达到杀伤真核细胞的目的。如果将带有neor基因的质粒导入细胞，并在含有G-418的培养基中培养，未转染的细胞被杀死，而存活的细胞便是转染细胞。 第五节 克隆基因的表达 ? 基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。 真核生物结构基因示意图 真核生物基因的结构特点 原核生物基因的结构特点 基因是连续的, 无内含子 一、大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达外源基因的优势 繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定 大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 如糖基化或磷酸化等修饰作用 2. 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白, 造成表达产物不稳定 （一）基因表达的基本要素 1．目的基因和密码子 (1)目的基因 目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA 。 cDNA的始密码子（ATG）上游部分（5ˊ端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。 (2)密码子 生物体对密码子的偏爱性 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 2．载体的选择 所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。 3．目的基因与载体的连接 （1）利用合适的接头进行连接引入ATG （2）融合蛋白 融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。有些载体的SD序列后面带有一段大肠杆菌蛋白质的结构基因，此结构基因的3ˊ端为多克隆位点，便于目的基因插入，经转录和翻译之后，即产生融合蛋白。 表达融合蛋白的优点 (1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。 (2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。 (3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。 (4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。 (5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。 4．受体菌株和诱导条件 (1)根据载体所携带的启动子选择特定的菌株 (2)诱导表达 5.表达蛋白的种类 (1) 分泌型异源蛋白的表达 ? 分泌表达形式的优点： 目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 分泌表达形式的缺点： 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。 (2)包涵体及其性质 外源基因表达产物在细菌内的存在形式有可溶性和不可溶性两种方式。表达产物在宿主中的存在形式是可变的。培养基的营养状况好，诱导表达的时间短，降低表达效率都有利于可溶性表达产物的形成。反之则容易形成不可溶性的表达产物即包涵体。 包涵体表达形式的优点： 能简化外源基因表达产物的分离操作 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 包涵体表达形式的缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白， 体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。 包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 。 包涵体的复性与重折叠（refolding） 包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性 6.分离、纯化表达产物 根据溶解性的特点，外源基因表达的蛋白质分为可溶性的和不可溶性的。提取可溶性的蛋白质时在非变性条