栉孔扇贝foxl2基因在卵子发生中的必要性-海洋科学.PDF

栉孔扇贝foxl2 基因在卵子发生中的必要性 刘晓玲, 刘 军, 王振东, 王振华, 李彦伸, 崔龙波 (烟台大学 生命科学学院, 山东 烟台 264005) 摘要: 采用 RNAi 技术研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)foxl 2 基因在卵子发生和卵巢功能维持中的作 用。使用体外合成的栉孔扇贝foxl2 双链RNA(dsRNA), 以每只50 μg/次的剂量注射进闭壳肌中, 连续 注射2 次(第一次注射后7 天, 再进行第二次注射); 以注射相同体积PBS(相同注射方法) 的扇贝作为阴 性对照组, 以不注射扇贝作为空白对照组。qRT-PCR 检测干扰组扇贝卵巢中的foxl2 mRNA 表达量较空 白对照组下降了62%, Western blotting 检测该蛋白在卵巢中的含量也明显下降, 显示靶基因的表达水平 被有效地敲降。组织学观察发现, 栉孔扇贝foxl2 干扰后的卵巢中卵母细胞形态异常、细胞核固缩, 卵 子发生明显受阻。表明该基因在栉孔扇贝卵子发生中起重要作用。 关键词: 栉孔扇贝; 卵巢; 卵子发生;foxl2 ; RNAi 中图分类号: S917 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2018)04-0127-05 DOI: 10.11759/hykx20180323001 FOXL2 是一种转录因子, 其在脊椎动物卵巢中 在 16℃左右的过滤海水中, 保持充气并每天更换海 高表达, 并在卵巢发育和卵巢功能维持中发挥重要 水。暂养期间以硅藻和绿藻为饵料进行投喂, 实验室 [1-4] [5] 作用 。Uda 等 研究发现: 敲除foxl2 基因的小鼠 内暂养3 d 后进行后续实验。 卵巢发育异常, 卵母细胞周围的体细胞无法完成形 1.2 RNA 干扰实验 态分化, 卵泡发育受阻, 卵母细胞虽能启动分化, 但 [6] 1.2.1 双链dsRNA 的体外合成 发育不正常。Unlenhaut 等 发现在foxl2 基因诱导缺 参照dsRNA 设计原则[10-11], 根据前期获得的栉孔 失的成体小鼠卵巢内, Sox9 的转录活性被激活, 组织 扇贝foxl2 基因序列(GenBank 注册号: JN642286)[9], 在 学观察到小鼠卵巢体细胞重编程向雄性特征细胞转 避免与家族基因以及其他基因序列出现连续重复的基 化。Schmidt 等[7]发现在foxl2 基因突变的小鼠卵巢中, 础上, 设计合成dsRNA 片段的一对引物P1 和P2(表1)。 颗粒细胞分化失败, 致使卵巢中卵泡池逐渐耗竭, 采用柱式动物RNAout 试剂盒(北京天恩泽公司) 卵母细胞闭锁。Foxl2 基因在无脊椎动物中的研究报 提取增殖期扇贝卵巢总 RNA, 利用 cDNA 反转录试 [8] [9] 道有限 。本文作者 前期对foxl2 在栉孔扇贝性腺 剂盒(