微生物学通报定点饱和突变提高LactobacilluscaseiL-乳酸脱氢酶对苯.PDFVIP

微生物学通报 Jul. 20, 2018, 45(7): 1401−1407 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170775 研究报告 定点饱和突变提高Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶对 苯丙酮酸的催化效率 1 1 1 1 2* 李雪晴 刘艳 袁风娇 李剑芳 邬敏辰 (1. 214122) (2. 214122) 摘 要：【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂，也是一种高附加值的手性分子，在食品、 制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192 的NADH 依赖型 L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备 L-苯乳酸，但其活性较 低。为提高 L-LcLDH 催化苯丙酮酸的催化效率，构建了一个单突变体 L-LcLDHQ88R ，其催化 效率kcat/Km 是L-LcLDH 的4.9 倍。【目的】为进一步提高L-LcLDHQ88R 催化苯丙酮酸的催化效 率，采用饱和突变技术将位于 L-LcLDHQ88R 底物结合口袋附近的氨基酸残基 Ile229 随机替换为 其他氨基酸，以获得活性更高的优良突变体。【方法】以重组表达质粒 pET-22b-LcldhQ88R 为模 板，采用全质粒PCR 技术对L-LcLDHQ88R 基因(LcldhQ88R) 中编码Ile229 的密码子实施饱和突变， 构建突变转化子文库。以催化苯丙酮酸的活性为指标，从文库中筛选出优良的突变转化子。【结 果】突变转化子(Escherichia coli/LcldhQ88R/I229Q)表达出一种由 Arg 和 Gln 分别替换了 Gln88 和 Ile229 的双突变体L-LcLDHQ88R/I229Q 。重组表达产物L-LcLDHQ88R/I229Q 的酶学性质分析表明： L-LcLDHQ88R/I229Q 的比活性是L-LcLDH 的18.5 倍，是L-LcLDHQ88R 的2.3 倍；其催化效率分别 为后两者的6.8 倍和 1.4 倍。L-LcLDH 突变前后的温度和pH 特性改变不大。根据分子对接结 果推测出，双突变Q88R/I229Q 导致L-LcLDH 的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能 对其催化活性的提高发挥了重要作用。【结论】双突变 Q88R/I229Q 显著提高了 L-LcLDH 的 活性和催化效率，使得L-LcLDHQ88R/I229Q 在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力 的工具酶。 关键词：Lactobacillus casei ，L-乳酸脱氢酶，定点饱和突变，苯丙酮酸，催化效率 Foundation item: National Natural Science Foundation of China *Corresponding author: E-mail: biowmc@126.com Received: September 28, 2017; Accepted: December 15, 2017; Published online () : January 15, 2018 基金项目： *通信作者：E-mail biowmc@126.com 收稿日期：2017-09-28 ；接受日期：2017-12-15 ；网络首发日期() ：2018-01-15 1402 微生物学通报