离心方法差分离心.PPT

离心 第十章 离心 第十章 第一节 第二节 离心 第十章 第一节 第二节 离心 第十章 第二节 制备型超离心技术 一、离心设备 （一）转子 1 角度转子 2 水平转子 3 区带转子 4 垂直管转子 5 连续离心转子 6 细胞洗脱转子 （二）离心管 由管体和盖组件两部分组成 二、离心方法 差分离心（离心沉降）、密度离心法（离心分离） （一）差分离心 概念： 差分离心法亦称为“差速离心法”，是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技术。 过程是将样品溶液在一定离心力场中离心一定时间使颗粒大组分沉降于管底，上层液再用加大的离心力场离心一定时间，又可获得中等大小的组分。如此依次提高离心力，逐级分离出所需组分，故称其为差分离心法。 用途： 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于颗粒或密度差别较大的组分的分离，或其他分离手段之前的粗制品提取。 （二）速度区带离心法 概念： 又称速率区带离心法或分级区带离心法。离心操作时将样品液置于连续或不连续，线性或非线性密度梯度液上（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），控制离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，从而达到彼此分离的目的。这种离心方法称速度区带离心法。 特点： （1）样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。 （2）介质的密度亦须严格掌握：梯度最大值≤组分最小密度。 （3）样品的密度＜梯度密度最小值。 （4）分离依据是各组分之沉降系数差。 （5）分辨率受组分沉降系数，离心时间，颗粒扩散系数，介质粘度及梯度范围和形状的影响。 用途： 本法适于分离颗粒大小不同而密度相近或相同的组分，如DNA与RNA混合物、核蛋白体亚单位及线粒体、溶酶体及过氧化物酶体等。 Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞 (一)　原理: 　　红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单核细胞。 　　(二)　方法: 　　1.　在短管中加入适量细胞分离液。 　　2.　取肝素抗凝静脉血，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。离心2000rpm×20分钟。 　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。 　　4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hanks液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 （三）等密度离心法 概念： 离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其密度与介质密度相等的位置便不再移动，形成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密度不同处于区带的不同位置。该离心方法称等密度离心法。 特点： （1）加样位置不拘。 （2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间影响。 （3）梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度。 （4）分离依据是颗粒组分间密度的差异，与颗粒大小，形状无关。 （5）离心力大小，组分颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。 Percoll 非连续等密度梯度离心法纯化牛肾上腺嗜铬细胞 疼痛和帕金森病，体外无增殖能力，只能依赖于肾上腺髓质的分离来获取。 实验动物年龄在1 岁左右的健康小公牛，体重约200～ 400 kg, 取小公牛肾上腺，D-Hank’s 溶液冲洗后，肾上腺充分消化后剥除皮质，将髓质剪碎成1 mm左右的小块，滴加少量DHank’s液以保持髓质的营养，将滤过的细胞悬液在100 × g 下离心8min， 将细胞悬液离心后与密度为1. 090 g / ml 的Percoll 溶液混合，加入离心管底部，在其上分别缓慢加入密度为1. 064 g / ml、1.034 g / ml、1.019 g / ml 的Percoll 溶液，室温下离心，200 × g，20min。收集介于密度为1.064 g / ml 与1.034 g / ml 的两层Percoll溶液界面之间的细胞，加入D-Hank’s 液混悬后，在100 × g 下离心洗涤2 次，每次8 min。得细胞。 五、密度梯度技术 （一）密度梯度的作用: 1.增加分离层次，提高分辨率。 2.防止温差及振动造成的影响。 （二）对密度梯度的基本要求 1 梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度。 2