高效液相色谱法(3).pptVIP

五、高效液相色谱法的计算 1.外标法 该法是应用最广泛的方法之一，其误差来源主要是进样误差，因此，分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验。 外标法 公式： 选择内标物应注意 理化性质与待测物相近 色谱响应与待测物相近 与待测物有良好的分离，但不能相距太远 与待测物的峰面积比为0.7-1.3最好，因此要根据待测物的浓度确定内标物的添加量 内标法 公式： （检出限可达10－12 g/cm3－ 10－13 g/cm3 ）， 5、附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。 梯度淋洗，指在分离过程中使流动相的组成随时间改变而改变。通过连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强度或pH等因素，使被侧组分的相对保留值得以改变，提高分离效率。 四.高效液相色谱法的使用技巧 1.分离类型的选择 高效液相色谱法的各种方法都各有其自身特点和应用范围，一种方法不可能是万能的，它们往往相互补充。应根据分离分析目的；试样的性质和量多少；现有设备条件等选择最合适的方法。一般可根据试样的相对分子质量大小，溶解度及分子结构等进行分离方法初步选择。 根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱，标准液相色谱类型(液—固、液—液、及离子交换色谱)最适合的相对分子质量范围是200-2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。 根据溶解度选择 如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳； 如样品可溶于烃类(如苯或异辛烷)，则可采用液—固吸附色谱； 如样品溶解于四氯化碳。则多采用常规的分配和吸附色谱分离； 如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液—液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 根据分子结构选择 （用红外光谱法简单判断样品中的官能团，确定采用的方法） 酸、碱化合物用离子交换色谱； 脂肪族或芳香族用液—液分配色谱、液—固吸附色谱； 异构体用液—固吸附色谱； 同系物不同官能团及强氢键的用液—液分配色谱。 2.流动相溶剂的要求 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 高纯度、低粘度、与检测器匹配。 优点： 1）不需所有峰都流出或被检测到 2）只对所测组分作校正 缺点： 1）进样量必须准确 2）仪器必须有良好的稳定性 2、内标法 在样品中添加内标物，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量。该方法减小了进样误差对定量结果的影响。 * * 第四讲 高效液相色谱法 一.高效液相色谱法简介 起源于20世纪60年代末至70年代初 融合了经典液相色谱和气相色谱的优点。 速度快、效率高、操作自动化 适用于蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分析。 比较高效液相色谱法 与经典液相色谱法 高速 高效液相色谱法在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 高效 由于高效液相色谱应用了颗粒极细(几微米至几十微米直径)、规则、均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高。 高灵敏度 由于现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使其分析灵敏度比经典色谱有较大提高。 高效液相色谱=高速液相色谱=高压液相色谱 高效液相色谱法与气相色谱法比较 三方面的优点 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的30％。占有机物总数近70％的高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 二.高效液相色谱仪结构 高效液相色谱仪的结构一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 高效液相色谱仪工作过程 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 1、高压输液系统 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成。由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件， 2、进祥系统 隔膜注射进样器 在色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。 优点：装置简单、价廉、死体