干细胞的体外培养.ppt

其它干细胞的分离与纯化 干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34+和Thy10+而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性 另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。 * ppt课件 （3）胚胎干细胞培养 有饲养层细胞培养： 将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度培养 2d后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化传代，消化时，消化30s后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为2-3min 加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。 无饲养层培养：明胶包被培养板，条件培养基。 已建系胚胎干细胞：将已培养2-3d生长旺盛干细胞消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照1：3或1：6比例转钟。 * ppt课件 注意事项： 最初分离的内细胞团以3-4个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。 培养条件要始终如一。 为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。 * ppt课件 （4）培养结果 hES细胞集落（×10） 胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。 * ppt课件 A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell * ppt课件 A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells. * ppt课件 5、胚胎干细胞的冻存和复苏 冻存液：胚胎干细胞培养液+10%-15%DMSO。 冻存细胞密度：106-107个/ml 冻存与复苏方法同普通细胞。 LIF条件培养基培养的细胞，仍然用不含LIF的胚胎干细胞培养液冻存。 * ppt课件 （三）胚胎干细胞的鉴定 1、 ES细胞生物学特性 （1）ES细胞形态结构及核型 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了二倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。 * ppt课件 （2）ES细胞生长特性 ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 ES细胞增殖迅速，每18—24 h分裂增殖 1次。 此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。 * ppt课件 * 人胚胎干细胞(hES)的特点 形态：圆形或椭圆，体积较小，核质比较大，体外抑制分化培养时呈鸟巢状，集落生长并紧密堆积，细胞界限不明显。 * ppt课件 （3）ES细胞的高度分化潜能 ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分 化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞， 悬浮培养中： “简单类胚体” ? “囊状胚体” ? 细胞分化物。 ES细胞可进行诱导分化 *用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞 分化为神经胶质细胞， *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩 的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞 组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重 构胚和动物个体。 * ppt课件 （4）碱性磷酸酶的表达 许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES