0703021F07生物大分子的液相色谱.DOCVIP

PAGE PAGE 2 分析化学 专业 博士研究生课程 《生物大分子的液相色谱实验》教学大纲 课程名称：生物大分子的液相色谱实验 课程编号：0703021F 学 分： 3 总学时数：60 开课学期：2 考核方式：开卷 课程说明：本课程是化学系分析化学专业分离科学方向硕、博士研究生的一门方向课。生物大分子的分离纯化是研究生物大分子的结构、性质的前提，也是生物制药技术中最关键的一步。生物大分子分离纯化中最常用的高效手段是液相色谱。本课程就是在研究生进行论文研究工作之前，对他们从最常用的蛋白质纯化理论、实验方法和实验技能进行培训，并初步培养他们分析问题和解决问题的能力，为顺利完成论文研究工作奠定良好的基础。本课程共包括8个实验，主要内容包括液相色谱柱的装填和柱效检测、RP-HPLC中SDT-R两组线性参数的测定、液相色谱中热力学函数的测、理论塔板数的测、Bradford比色法测定蛋白质含量、高效疏水作用色谱分离蛋白质、排阻色谱分离蛋白质、十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 教学内容、要求及学时分配： 实验一 色谱柱的装填和柱效检测（5学时） 教学要求： 了解色谱柱的结构，了解色谱柱装填方法的分类以及装填效果对色谱柱分离结果的影响。掌握新加工不锈钢色谱柱空管的处理方法，了解柱内壁的光滑和干净程度对柱效的影响。掌握匀浆法装填色谱柱的方法、原理和要领，并掌握选择匀浆剂和顶替剂的标准。掌握蛋白质色谱柱柱效检测的基本方法和原则。了解柱头塌陷等原因引起的色谱柱柱效降低的修复方法。 实验二 RP-HPLC中SDT-R两组线性参数的测定（8学时） 教学要求：加深对液相色谱中的计量置换保留理论的理解。通过研究芳香醇同系物在RP-HPLC各种流动相组成中的保留行为，熟悉掌握反相高效液相色谱的保留机理。根据计量置换保留理论（SDT-R）,运用作图法求出两组线性参数：Z与lgI；j与lg?。进一步掌握这两组线性方程的适用范围，并了解其在液相色谱理论研究中的实际应用。通过实验加深对反相液相色谱中同系物保留的碳数收敛现象的理解以及研究收敛的方法。 实验三 液相色谱中热力学函数的测定（8学时） 教学要求：依据液相色谱中计量置换保留模型（SDM-R）,熟练掌握反相液相色谱中溶质保留过程的热力学基本概念、基本方程和基本关系式。学习将lg k′与柱温的倒数1/T作图，利用线性Vant’Hoff公式，求出该过程的热力学参数（△HKd，△SKd，△GKd）。了解Vant’Hoff公式的三种常见关系式。了解用Vant’Hoff作图研究色谱热力学的原理和方法。 实验四 理论塔板数的测定（4学时） 教学要求：复习塔板理论和速率理论，了解影响柱效的因素。掌握理论塔板数的计算公式和测定方法。理解溶质种类对理论塔板数测定的影响。掌握折合塔板高度和折合塔板数的定义和计算方法，了解knox曲线的用途。 实验五 Bradford比色法测定蛋白质含量（4学时） 教学要求：了解蛋白质含量测定的几种常用方法及其原理和优缺点。掌握用Bradford法测定蛋白质含量的原理和操作步骤以及注意事项。 实验六 高效疏水作用色谱（4学时） 教学要求：进一步掌握高效疏水作用色谱的分离原理、优缺点和适用范围；掌握疏水作用色谱和反相色谱的异同点。掌握疏水填充柱的装填和流动相的配制，掌握用高效疏水作用色谱分离蛋白质的操作。了解用疏水作用色谱分离蛋白质时的主要影响因素以及分离条件的选择方法。了解疏水色谱柱的再生方法和操作。 实验七 排阻色谱（2学时） 教学要求：进一步了解排阻色谱的分离原理、分类和主要应用范围。掌握排阻色谱固定相选择的主要依据。掌握用排阻色谱对蛋白质进行分离和脱盐的方法。掌握AKTA Explore 100液相色谱系统的操作。 实验八 十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（5学时） 教学要求：掌握十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）的原理和基本实验步骤，了解影响电泳效果的因素。了解电泳仪的基本构成。掌握电泳中各种溶液的配置方法。掌握蛋白质的三氯乙酸沉淀、电泳样品制备、铸胶、卸胶等操作。掌握考马斯亮蓝染色和硝酸银染色的原理和操作方法。了解利用SDS进行蛋白纯度分析的方法，了解蛋白质量回收率的计算方法。 教材和教学参考书 教材：自编讲义 参考书： 郭立安，高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术，陕西科学技术出版社，1993年 耿信笃等，蛋白折叠液相色谱法，科学出版社，2006年 大纲编制人：王超展 大纲审定人：耿信笃