分光光度技术基础 基本原理： 利用紫外光、可见光、红外光和激光等.docVIP

分光光度技术基础 基本原理： 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本文重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。 1. 光谱： 光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。 光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。 光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。 λ＝C/ν λ——波长 C——光速 ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。 光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出： E＝h?ν H——普朗克常数（ 6.624×10-27尔格?秒） ν——频率 紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm～400nm。可见光区为400nm～800nm。 组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成： E＝E-0+E平+E转+E振+E电 E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。 分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系： E＝E2- E1＝h E-1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。 可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。 与吸收光谱有关的三种电子是： ⑴ 二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称σ 键， 构成 键的电子称 σ电子，如C－C、C－H键。 ⑵ 平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称π 键，形成π键的电子称为 π电子，如C=C键。 ⑶ 未共享成键的电子，称n电子。 各种电子跃迁所需能量大小的顺序是： n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ* 紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等。 如下表所示： 电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系表 电子跃迁类型 例 子 紫外吸收波长范围 σ→σ* C－H 100～150 nm π→π*( 非共轭 ) C＝O ＜200 nm π→π*( 共轭 ) ＝C－C＝ 200～300 nm n→π* C＝O ～300 nm π→π*跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200～300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200～300 nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出