生物化学实验一 蛋白质和氨酸的呈色反应.docVIP

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应 目的要求 验证蛋白质特性；学习和掌握蛋白质呈色反应的原理和方法；学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 实验原理 蛋白质中的某些化学键或氨基酸残基中的某些化学基团可以与某些特殊试剂形成特定的有色物质。这些反应称为蛋白质的呈色反应。 各种蛋白质的氨基酸残基不完全相同。因此，呈色反应产物的颜色也不完全一样。呈色反应不是蛋白质所特有，一些非蛋白物质也能呈现类似的呈色反应。因此，不能仅以呈色反应结果来判别被测物质是否为蛋白质。 呈色反应 双缩脲反应 1.原理 两分子尿素经加热至180°C后可以缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成紫红色络合物，此反应称为双缩脲反应。 多肽及所有蛋白质均具有肽键，与双缩脲分子中亚酰胺键结构相同，也能发生此反应，因此，蛋白质在碱性溶液中与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的颜色反应。 2.器材与试剂 1)器材 试管、药匙、电炉、试管夹、滴管。 2)试剂 〈1〉蛋白质溶液(10%卵清蛋白溶液)：吸取鸡蛋清溶液10ml，加蒸馏水稀释，定容至100ml。 〈2〉10%氢氧化钠溶液。 〈3〉1%硫酸铜(CuSO4)溶液。 〈4〉0.1%甘氨酸(Gly)溶液：称0.1g甘氨酸溶于蒸馏水中，稀释至100ml。 〈5〉结晶尿素。 3.实验步骤 双缩脲反应实验 (1)制备双缩脲：取结晶尿素少许(约火柴头大小)，放入干燥的小试管中。微火加热至尿素熔解至硬化，刚硬化时立即停止加热，尿素放出氨，此时双缩脲即已形成。冷却后作为双缩脲样品(1号管)。 (2)另取3支试管，与1号管一起按表加样，混匀，观察各管颜色变化，记录结果并解释现象。 茚三酮反应 1.原理 蛋白质或氨基酸在弱碱性条件下，其上的氨基与茚三酮共热可产生蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α-氨基酸所共有，具有亚氨基的脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生特征性的黄色化合物，含有氨基的其他化合物也能呈此反应。 2.器材与试剂 1)器材 滤纸、试管、试管夹、药匙、电炉、滴管、吸管、水浴锅。 2)试剂 〈1〉卵清蛋白溶液100ml：与双缩脲反应相同。 〈2〉0.1%甘氨酸(Gly)溶液。 〈3〉0.1%茚三酮水溶液。 〈4〉0.1%茚三酮-乙醇溶液：0.1g茚三酮溶解于乙醇中并用乙醇定容至100ml。 3.实验步骤与结果观察 (1)取两支试管，按表加样。 茚三酮反应实验 (2)另取一张滤纸，滴一滴0.1%Gly溶液，风干后，在原处滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 黄色反应 1.原理 在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)残基上的芳香环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，后者在碱性条件下可转变为橘黄色的硝醌衍生物。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少许浓硫酸后才会有黄色反应。 2.器材与试剂 1)器材 同茚三酮反应 2)试剂 〈1〉卵清蛋白溶液100ml：与双缩脲反应相同。 〈2〉10%氢氧化钠溶液。 〈3〉头发。 〈4〉指甲。 〈5〉0.5%苯酚溶液。 〈6〉浓硝酸。 〈7〉0.3%色氨酸(Trp)溶液。 〈8〉0.3%酪氨酸(Tyr)溶液。 3.实验步骤与结果观察 取6支试管，按表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢，可置沸水浴加热5min。 蛋白质的黄色反应实验 待各管出现黄色后于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。 实验结果： 双缩脲反应： 1号管紫红色，2号管浅紫色，3号管蓝紫色，4号管蓝紫色。因为多肽及所有蛋白质分子均具有肽键，与双缩脲分子中亚酰胺键结构相同，也能发生此反应，因此，蛋白质在碱性溶液中与铜离子也能呈现出类似双缩脲的颜色反应。 茚三酮反应： 观察紫红色斑点 黄色反应： 1号、2号、3号、4号、5号、6号试管都出现黄色。于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，1号、2号、4号、6号试管变为橘黄色。3号、5号实验失败，没有出现橘黄色。