基于单分子定位超分辨显微中荧光激发密度优化.pdfVIP

生物物理学报 2014年8月 第 30卷 第5期：380-390 www．cjb．org．cn ACTA BIOPHYSICA SINICA Vo1．30No．5 Aug．2014：380—390 基于单分子定位的超分辨显微 中 荧光激发密度的优化 杨 光 1,2,3， 熊大曦 ， 梁 永 ， 李 辉 1．中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 ，江苏省医用光学重点实验室 ，江苏苏州 215163 2．中国科学院长春光学精密机械与物理研究所，长春 130033； 3．中国科学院大学，北京 100039 收稿 日期：2014—04．15；接受 日期：2014—08—20 基金项 目：国家 自然科学基金项 目 通讯作者：李辉，电话：f0512E—mail．hui．1i@sibet．ac．crl 摘要：基于单分子定位 的超分辨显微技术中，荧光点的中心位置可通过对每个 荧光点进行单点 扩散 函数 (pointspreadfunction，PSF)逐个拟合定位或对多个荧光点进行多PSF同时拟合定位 获得。定位误差以及 图像采样 时间与荧光激发密度直接相关。为定量得到基于这两种算法的最 优荧光激发密度 ，模拟 了成像与定位过程 ，比较 了常见的几种荧光分子在采用基于单PSF逐个 拟合和多PSF同时拟合两种算法定位时的中心定位误差、荧光获取 比率、获取 的有效荧光点数 与荧光激发密度间的关系。进而得到了采用这两种算法对不 同荧光染剂进行超分辨成像时的最 优荧光激发密度。该结果对单分子成像过程 中荧光激发密度的选择和激发激光 的强度控制具有 指导意义。 关键词：显微 ；荧光；单分子定位 ；激发密度 中图分类号：Q．334 DoI：10．3724／SP．J．1260．2014．40049 引 言 荧光显微镜在生物医学领域有着广泛的应用。但是，包括共聚焦显微镜在内的传统光 学显微镜受到阿贝光学衍射极限的限制 1_『，其分辨率只能达到200nlTl以上。近年来发展的 基于单分子定位的超分辨荧光显微技术突破了衍射极限，可以达到 20nnl的横 向分辨率， 因此成为生物医学显微成像领域的一个研究热点21『。根据所用荧光染剂的不同，基于单分子 定位的超分辨显微技术主要有采用有机荧光分子的随机光学重建显微术 (stochasticoptical reconstructionmicroscopy，STORM)t、采用荧光蛋 白的光激活定位显微术 fphotoactivated localizationmicroscopy，PALM 4[1和 FPALM [5]1， 以及采用量子 点 的闪烁超分辨 显微术 fblinkingsuperresolutionmicroscopy)t~等。它们的基本原理都是在成像时使大多数荧光分子 处于不发光的暗态，而只有少数荧光分子被随机激发，用点扩散函数对每个发光分子的光 强分布进行拟合得到其中心位置；重复得到很多帧图像，进行 同样的处理，标记出几乎所 杨光等：基于单分子定位的超分辨显微中荧光激发密度的优化 有荧光分子的位置，从而构建出最终的高分辨图像。因此，可通称为单分子定位超分辨显 微术 (singlemarkerlocalizationsuper．resolutionmicroscopy)。 单分子定位超分辨显微术 已经被广泛用于研究细胞线粒体与骨架结构 、网格蛋 白 Clathrin介导的细胞内吞过程罔，以及神经突触结构9[】等生物医学基础问题．2011年，Jones 等人[10J用高亮度的Alexa647有机荧光分子修饰 ，实现 了 1S时间分辨率、20nm横向分辨 率、50am轴 向分辨率的三维活细胞成像，超分辨的图像结构显示网格蛋 白Clathrin包围在 50nln的转铁蛋白Transferrin周围，形成 100~200nm 的半球壳结构。Xu等人[11】通过具有 更高分辨能力的双物镜 STORM 系统成功分辨出了神经轴突的骨架结构 ，发现肌动蛋白 Actin形成周期性的环形结构，而树突中的肌动蛋白形成贯穿的长纤维结构。 黄波等人[7】在对全细胞进行STROM 成像时，发现线粒体拥有球状和管状两种类型，并 测出这两种线粒体的尺寸范围。该组还通过3D STORM 方法分辨出了猴子肾脏BS．C．1细 胞线粒体外膜的中空结构，并观察了线粒体与细胞微管的相互作用，对细胞生物学的研究 具有重要意义。哈佛大学的xu[1l】通过具有更高分辨能力的双物镜STORM系统