重组dna技术与基因工程讲义.pptVIP

重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 酵母作为表达外源基因受体的特征 A 酵母作为表达外源基因受体的特征 B 酵母的宿主系统 C 酵母的载体系统 D 酵母的转化系统 E 酵母的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 G 酵母糖蛋白生产的人源化改造 H 酵母转录机器的基因工程综合改造 E 酵母的表达系统 6 外源基因在酵母中的表达 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重 的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其 中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒 还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒 感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其 广泛应用提供了可靠的保证。 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒颗 乙型肝炎病毒的结构 粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要结构 蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖 基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22 聚合酶、微量病毒蛋白。 nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的 1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因 ATG ATG ATG TAA 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S S 多肽 226 aa M 多肽 281 aa L 多肽 399 aa 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫 传统乙肝疫苗的制备 苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的 疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括 将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活 性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平 均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中 的病毒颗粒相同。 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化 重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。 进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作 用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗 原缺乏响应的人群的免疫反应。 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建 PARS2 Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 Bgl II pBSAG151 11 kb Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 his+的转化子 重组分子 转化his-的受体细胞 染色体DNA 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 重组巴斯德毕赤酵母的性能 由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因 AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲 醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3% 在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐 中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝 疫苗。 6 外源基因在酵母中的表达 除抗体外，哺乳动物绝大多数糖蛋白的半衰期和功能依赖于糖链末端的唾液酸，其它裸露的末端糖（如甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖等）会被糖特异性的受体或凝集素清除。由于不少药用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生产目前只能依靠哺乳动物受体，因为后者能进行人样化的N-糖基化反应，包括在末端加唾液酸的能力。酵母和丝状真菌作为重组蛋白表达系统，与哺乳动物细胞相比，具有较高的重组蛋白表达率、较短的发酵周期、能在化学成分确定的培养基中生长等很多优势。然而，野生型酵母往往将高甘露糖型的多糖链加在蛋白质上，直接影响表达产 物在人体内的稳定性与功效。 ER ER 两种多糖合成途径的比较 人类糖蛋白侧链多聚糖的成熟，涉及下列基因编码的酶系： MnsI： ?-1,2-甘露糖苷酶 I MnsII： ?-1,2-甘露糖苷酶 II GnTI： ?-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶 I GnTII： ?-1