重组克隆的筛选和鉴定讲义.ppt

第七章 重组克隆的筛选和鉴定 内容提要 第一节 载体表型选择法 第二节 DNA电泳检测法 第三节 核酸杂交检测法 第四节 免疫化学检测法 第五节 转译筛选法 第六节 真核重组基因的选择方法 一般克隆与筛选策略 第一节 载体表型选择法 根据载体提供的表型进行选择的方法： 抗生素抗性基因的插入失活选择法 ?-半乳糖苷酶的显色反应选择法 一、插入失活法的原理 一般原理 一种利用抗生素抗性基因或其他基因的插入失活，来筛选重组子的方法。 通常外源DNA插入的位点设计在特定基因上，一旦外源DNA插入，该基因就被破坏而失去活性。由此来判断载体上是否带有外源DNA。 二、利用抗生素抗性基因：pBR322 以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。 1. 原理 在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。如果有外源DNA插入BamH I位点，那么涉及四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失（敏感）。 2. 筛选的方法 ①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，并培养至菌落出现。 ②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下。 ③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就是含有重组pBR322质粒的重组子。 图 pBR322的结构图 3. 抗菌素标记的选择 （1）Ampr 氨苄青霉素抗性基因 产生?-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色。 Ampr有Pst I、Sca I等多个插入位点。 （2）四环素 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （3）环丝氨酸 杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。 4. 选择的过程 （1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素﹢环丝氨酸的平板，选择重组克隆。 Tetr插入失活的细菌，其生长可被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的细菌，能抗四环素，正常生长，但可被环丝氨酸杀死。 图 四环素抗性插入失活 （2）氨苄青霉素抗性插入失活 氨苄青霉素抗性基因编码产生?-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液褪色。 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青霉素指示液褪色呈蓝灰色。据此选择阳性克隆。 图 氨苄青霉素抗性插入失活 三、利用?-半乳糖苷酶显色 选择重组子的原理 1. ?-半乳糖苷酶与Lac Z基因 由E.coli lac操纵子上的Lac Z基因编码。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。 2. Lac Z?基因 突变的Lac Z基因，只编码?-半乳糖苷酶的部分肽段（氨基端） 。 2. 培养基中IPTG、X-gal 的作用 （1）IPTG作用 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导lacZ 基因的表达?-半乳糖苷酶。 （2）X-gal作用 5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷。作为?-半乳糖苷酶水解的底物。 （3）X-gal的显色反应 β-半乳糖苷酶 (四聚体)将X-gal水解成半乳糖苷和蓝色的吲哚衍生物(靛蓝) 。在4℃蓝色加深。 3. ?-互补作用 ?-互补作用是pUC质粒载体的特性。 pUC载体：含有Lac Z?基因，编码?-半乳糖苷酶的部分肽段（ ?片段，氨基端） 。 受体菌：基因组中带有突变的?-半乳糖苷酶基因（缺失?片段），可被IPTG诱导表达（只编码?-半乳糖苷酶的?-肽）。 载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸收了带有LacZ?基因的 pUC质粒，才能合成完整的有活性的?-半乳糖苷酶。 pUC18/19的结构图 氨苄青霉素抗性基因 Lac Z?基因：编码?-半乳糖苷酶的部分肽段。 Lac Z?上有插入外源DNA的MCS位点。 4. 筛选的方法：蓝白斑法 利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是一种直接检测?-半乳糖苷酶活性的方法。 ①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培养基，能合成?-半乳糖苷酶。 ②然后再通过检测?-半乳糖苷酶的活性，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，又能合成?-半乳糖苷酶的细胞，就是重组子细胞。 ③?-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培养基中，那些能合成完整的?-半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子克隆因Lac Z?基因被破坏，不能合成完整的?-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色。 5