三醋酸纤维素薄膜分离血清蛋白.DOCVIP

实验三 醋酸纤维素薄膜分离血清蛋白 实验类型：验证型 目的和要求 掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。 原理 采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结构球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。 操作方法 一、仪器和薄膜的准备 1. 醋酸纤维素薄膜的润湿和选择：取2cm×8cm的薄膜，于无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻轻地划一直线，然后将薄膜小心放入盛有缓冲溶液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一致的条纹或斑点等，则为不均匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。 将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。 2.制作“滤纸桥”：剪裁尺寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。 3.平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要平衡15—20分钟。注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。 二、点样 在薄膜无光泽的一面点样。点样时，先用毛细管蘸取血清，点加在原划好线的1.5厘米处（见图1），一般点加2-3次。注意，应使每次点样同心圆，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。 三、电泳 将已点样的薄膜 使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上（见图2），点样端靠近负极。平衡10分钟，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3毫安，通电10—15分钟后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为15伏左右，薄膜每厘米宽的电流强度为0.4—0.6毫安。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约3.5厘米时，则关闭电源，一般通电时间为50分钟左右。 四、染色 电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5分钟。然后，用漂洗液浸洗，隔5分钟左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。 五、结果判断 一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。 试剂和器材 一、试剂 (1)新鲜血清——无溶血现象。 (2)巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液（PH8.6，0.07M，离子强度0.06）：称取巴比妥1. (3)染色液：称取氨基黑10B 0. (4)漂洗液：取95%乙醇45毫升，冰乙酸5毫升和蒸馏水50毫升。混匀，在具塞试剂瓶内贮存。 (5)透明液： 甲液——取冰乙酸15毫升和无水乙醇85毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液——取冰乙酸25毫升和无水乙醇75毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 二、器材 （1）醋酸纤维素薄膜——2cm×8cm （2）培养皿（直径9—10cm） （3）毛细管 （4）直尺和铅笔 （5）镊子 （6）电泳仪和电泳槽 （7）普通滤纸 （8）染色缸 思考题 ⒈电泳中，血清样品点在支持介质的哪一端？为什么？ ⒉引起电泳图谱不整齐的原因是什么？