响应面法优化枯草芽孢杆菌产脂肪酶的合成培养基.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（８）：１００１０５ 响应面法优化枯草芽孢杆菌产脂肪酶的合成培养基 宋　萍　戚小灵　胡　邁　谢宁昌 （南京工业大学生物与制药工程学院　南京　２１０００９） 摘要　对枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＩＣＣ２００３４利用合成培养基液体发酵产脂肪酶的条件 进行了优化。首先采用单因子实验筛选出最适诱导剂为三丁酸甘油酯，氮源为尿素，碳源为葡萄 糖，无机盐为ＭｇＳＯ。在此基础上，利用ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计对影响产酶因素的效应进行评价，筛 ４ 选出具有显著效应的三丁酸甘油酯、尿素、ＫＨＰＯ和培养基起始ｐＨ值４个最显著的因素。用最 ２ ４ 陡爬坡路径逼近最大产酶区域后，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，获得最适合成 培养基组分为：葡萄糖８ｇ／Ｌ，尿素８．５７ｇ／Ｌ，三丁酸甘油酯２．６２％，ＫＨＰＯ２．５９ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ · ２ ４ ４ ７ＨＯ０．５ｇ／Ｌ，ＴｒｉｔｏｎＸ１０００．５ｇ／Ｌ，ｐＨ９．４７。优化后的Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＣＩＣＣ２００３４胞外脂肪酶活力达 ２ ０．４８３Ｕ／ｍｌ，比初始酶活力０．０７２Ｕ／ｍｌ提高了６．７倍。 关键词　脂肪酶　枯草芽孢杆菌　ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计　响应面法　优化 中图分类号　Ｑ８１５ 　　脂肪酶（ＥＣ３．１．１．３）是一类水解和合成长链脂 １　材料与方法 肪酸甘油酯的生物催化剂，广泛应用于油脂加工、洗 涤、食品加工、医药、化妆业、皮革加工、饲料、造纸、有 １．１　材　料 ［１］ 机合成、精细化工以及生物能源等领域 。作为一种 １．１．１　菌种　枯草芽孢杆菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＣＩＣＣ２００３４ 高效无污染的脱脂剂，脂肪酶在皮革脱脂工艺上尤其 （中国工业微生物菌种保藏中心）。 具有重要的用途，且在碱性条件下使得脂肪更易从皮 １．１．２　培养基　种子培养基 （ｇ／Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母 中除去。与传统的皂化法、乳化法和溶剂法脱脂相比 粉５、ＮａＣｌ１０。 较，酶法脱脂皮板柔软、富有弹性、粒面毛孔清晰、毛发 　　初始发酵产酶培养基 （ｇ／Ｌ）：葡萄糖８、ＫＨＰＯ２、 ２ ４ ［２］ 光亮柔软，对皮革质量有明显的提高 。 ＭｇＳＯ ·７ＨＯ０．５、ＴｒｉｔｏｎＸ１０００．５、橄榄油 ２％ （ｖ／ ４ ２ 　　枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）是产胞外脂肪酶的 ｖ）、尿素 １０。 典型微生物，其脂肪酶因对碱性环境有较高的耐受力， １．２　方　法 ［３］ 应用潜力巨大 。同时Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ具有分泌性强、细胞 １．２．１　发酵培养　自斜面取１环菌接入装有５０ｍｌ种 壁不含内毒素和发酵性能良好等特点，使得Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ 子培养基的三角瓶中，３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养２４ｈ。以 倍受遗传工程界的重视，成为继大肠杆菌之后又一具 １．５％的接种量接入２５０ｍｌ装有５０ｍｌ发酵产酶培养基 有商业潜力的基因工程表达系统。但国内外报道Ｂ．