均匀设计法优选大鼠单个胃肠平滑肌细胞分离方法研究.PDFVIP

第32卷 第4期 甘肃 中医学 院学报 Vol．32　 No．4 2015年8月 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 J．GANSU COLLEGE OFTCM　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 Aug.2015 ·实验研究 · 均匀设计法优选大鼠单个胃肠平滑肌细胞分离方法的研究 1 1 1,2 3 1,2 妥海燕 ,刘五州 ,吴国泰 ,高云娟 ,任　 远 (1.甘肃中医药大学药学院,甘肃　 兰州　 730000; 2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室,甘肃　 兰州　 730000; 3.南充市食品药品检验所药品不良反应检测中心,四川　 南充　 630000) 摘要:目的　 优选大鼠单个胃肠平滑肌细胞的分离方法。 方法　 采用4 因素5 水平均匀设计实验,以细 胞形态评分和有效细胞数为评价指标,研究酶解法消化分离单个大鼠胃肠平滑肌细胞的最佳实验条件。 结 果　 分离单个胃平滑肌细胞的最优条件为0.020%大豆胰蛋白酶抑制剂与0.40% Ⅱ型胶原酶联合催化,温 度30 ℃,消化2 h;分离单个肠平滑肌细胞的最优条件为0.005%大豆胰蛋白酶抑制剂与0.10% Ⅱ型胶原酶 联合催化,温度34 ℃,消化2.5 h。 结论　 通过均匀设计实验能优选大鼠单个胃肠平滑肌细胞分离条件,方 法简便可行。 关键词:均匀设计;胃肠平滑肌细胞;酶解法;分离方法 - 中图分类号:R 332　 文献标志码:B　 文章编号:1003-8450(2015)04-0001-05 　 　 胃肠平滑肌细胞形态研究和原代细胞培养都需 2mol/ L 的NaOH溶液调节pH至7.4,补充液体量 要单个平滑肌细胞作为研究对象,分离单个胃肠平 至1000 mL。 戊二醛固定液的配制:取50%戊二醛 滑肌细胞是开展实验研究的基本技术要求。 目前主 1mL加入19 mL生理盐水中,4 ℃冷藏保存。 台盼 - [1 4] 要的分离方法 是采用 HEPES-Ringer 缓冲液配 蓝溶液的配制:将0.25 g 台盼蓝染料研磨后溶于 制的不同浓度的大豆胰蛋白酶抑制剂和Ⅱ型胶原酶 25 mL 的生理盐水中,摇匀后过滤,备用。 酶消化液 消化液,在一定温度下消化胃肠道平滑肌肌条或肌 用缓冲液临用前配制。 - [5 9] 块,分离条件影响因素较多,研究者们 通过改变 1.2　 主要仪器 酶的浓度、消化时间和消化温度以期获得更好的分 荧光显微镜 (BX51-32H01 型, 日本 OLYM- 离条件。 为了探索大鼠单个胃肠平滑肌细胞的分离 PUS),恒温磁力搅拌器(C-MAG HS 7 digital 型,德 技术条件,本研究采用均匀设计法优选分离条件,研 国 Chiron-Werke GmbH Co. KG),电子天平 究不同的酶浓度、消化时间和消化温度对单个胃肠 (CPA124S型,德国Sartorius),离心机(XYJ80-2型, 平滑肌细胞分离的影响,以期为胃肠道平滑肌细胞 金坛市恒丰仪器厂),pH计(雷磁 PHS-3C 型,上海 试验提供方法依据。 仪电科学仪器股份有限公司)。 1　 材料与方法