实验11 细胞的分离和纯化.pptVIP

* * 实验１1 细胞核的分离和纯化 一、目的要求 掌握细胞核的分离、纯化的一般原理 和操作方法。 　二、实验原理 　　柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质中DNA的正常结构与活性。将肝组织剪碎后，在柠檬酸溶液中制备匀浆，使肝细胞破碎而获得无细胞悬液。如将此种细胞核保存在等渗（0.25mol/L）蔗糖溶液中（内含微量Ca2+，以防止核聚集并减少细胞核的脆性），可以较好地保持其完整的正常结构。 　　在此条件下离心分离得到的仅是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88 mol/L或更高浓度（通常用2.2 mol/L）的高渗溶液，适当调整离心力，即可得到纯化的细胞核沉淀。 　三、操作步骤 （一）肝匀浆的制备 新鲜大鼠肝以0.15 mol/L NaCL充分洗净后，用滤纸吸干水分，除去结缔组织并剪碎，称取0.5g肝组织加9份体积的0.08mol/L柠檬酸溶液，制成匀浆。将匀浆液用双层200目尼龙布过滤3次，滤去残渣。 （二）分离细胞质与细胞核 １.　将匀浆液4.5mL倒入离心管中，用4000r/min离心20~30min，将含细胞质的上清液移入一试管中备用。 ２.沉淀中加入0.25mol/L蔗糖-柠檬酸溶液1mL，玻棒搅匀。此为核悬液。 ３.另取离心管1支，加0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液5mL，用滴管取核悬液，沿管壁缓缓铺于液面上，2000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀即为初步纯化的细胞核。 ４.用5mL核洗液洗涤沉淀，再以2000r/min离心10min，弃去上清液，再重复沉淀1次，白色沉淀即为纯化的肝细胞核。 大鼠肝匀浆液４.５ｍｌ 　　　　? 4000r/min离心20~30min 沉淀 　　　上清液（即细胞质、保留） ? 悬浮于0.25mol/L蔗糖-柠檬酸溶液（1ml）中 ? 铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液（5ml）面上 ? 2000r/min离心10min ? ? 上清液（弃去） 沉淀 　　　　　　　　　　　? 悬浮于Tris-HCl-NaCl溶液（5ml）中? ? 2000r/min离心10min | ? 上清液（弃去）　　　　 沉淀 ? 悬浮于0.02mol/L NaOH（5ml）中 ? 纯化核悬液 ? ? 四、结果与计算 　　澄清透明的为细胞质，乳白色沉淀为细胞核悬液，用于下一次实验。 五、应用意义 　　核酸是构成生物体最主要的组成成份之一，并和蛋白一起构成生命的主要物质基础。它是遗传信息及基因表达的物质基础，在生物种族遗传、生长繁殖和分化发育等方面起着决定性的作用。此外，它与生命的异常活动如肿瘤发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药物的作用机理等也有着密切的关系。 　　 　　目前核酸的研究已成为生物化学、分子生物学、医学及农学等学科的重点研究课题，也是现代生物学中最活跃的研究领域。但不论是研究核酸的理化性质，还是研究核酸的结构和功能，首先就是需要对核酸进行分离纯化和鉴定，因此，核酸的制备及分析是研究核酸的前提和基础。 六、注意事项 　　红细胞与细胞核大小相似，且与核一起沉淀，不易分离，故在用0.15mol/L NaCl洗去血液时，务必将血液洗净。 　　制备匀浆和细胞核悬液稀释所用的体积比例，一定要准确，以便定量测定。 　　梯度离心时，转速不能过快，加速及减速均要缓慢进行，以避免两层混合。 *