高效液相色谱.pptVIP

液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用是以HPLC为分离手段，MS为检测器的一门综合性分析技术，它集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体的技术。它以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作。可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围广，而且不需衍生化步骤。 液—质联用分析锦绣杜鹃叶黄酮类成分 黄酮类化合物 一级质谱中大多以准离子分子形式存在，有少量碎片离子。二级质谱中碎片信息则较少，主要峰的质谱图见图 3 ～7。根据分析液相中的色谱峰与总离子流图中所对应的离子峰的质谱信息，并结合相关文献的报道，对锦锈杜鹃 HPLC 分离出的5 个主要峰进行分析，推断出其可能的结构 。 质谱负离子模式的总离子流图与 356 nm 波长下紫外色谱图基本吻合，但总离子流图的基线噪声较大。 结果分析 1903年提出、1969～1970年开始发展 原理：以液体为相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的检测 技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器 实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化分析。 通过高压泵，将流动相抽入柱子 1 通过进样器，注入样品混合物 2 3.由于混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。 4.通过检测器检测，得到组分的电信号并进行放大；记录仪将放大的电信号以图形形式记录下来。 1.高压 一般：150～300kg/cm2 ,甚至：500kg/cm2 为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压 2.高速 两相间交换千分之几秒，分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟) 通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内可完成 3 高效 气相：2000塔板/米，液相：5000塔板/米 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业蒸馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍 4.高灵敏度 紫外检测器：10－9g数量级 荧光检测器：10－11g(百万分之几），试样量小（几微升） 5.高选择性 可分析在性质上极为相似化合物 （手性化合物、同位素、同分异构、空间异构） 相同点 不同点 1.都是重要的分离、分析手段 2.气相的基本理论（塔板理论、定性定量方法） 3.基本术语（色谱参数、色谱图、色谱柱效） 1.应用范围： 气相：易挥发、热稳定 液相：不易挥发、热不稳定 但具有一定溶解性化合物，不适合气体。 2.流动相作用： 气相：运载样品，不影响色 谱分离 液相：运载样品，参与、影响色谱分离，且起主要作用。 3.分析样品： 气相：破坏样品，不能回收。 液相：不破坏样品，能回收。 ⅰ液固吸附色谱（LSC) （ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离） ⅱ液液分配色谱（LLC） （利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度不同而分离）（键合相色谱 60％） ⅲ离子交换色谱（IEC） （利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固定相的亲合力不同而分离） ⅳ体积排阻色谱（SEC) （利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不同而分离） 上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各色谱方法在相关领域应用互相补充。 一、泵系统 通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系统密封性能好。 目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。 二、进样系统 六口旋转进样阀示意图 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。 工作原理：手柄位于取样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。 三、色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、