ELISA培训PPT.pptVIP

ELISA（Enzymes linked immunosorbent assay） * 目录 1 2 3 4 ELISA原理 ELISA简介 ELISA实验步骤 ELISA相关仪器、试剂 ELISA简介 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它是实验室最常用的检测方法。?酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过所有人造催化剂，ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。使用酶去标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。 1.抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持器免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。 2.抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 3.酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进行定性或定量分析。 ELISA基本原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。 ELISA类别 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，先将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成正比。 双抗体夹心法 当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。 竞争法 双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。 双抗原夹心法 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 间接法 除了以上常见的4种检测方法外，还有直接法、捕获包被法、竞争法（测抗体）、双抗原夹心法、ABS-ELISA法等其他方法。 ELISA实验过程主要分以下三步： 第一：实验设计 1.了解将要测定的样品属于什么类别，选用最佳的ELISA检测方法； 2.选用正确的阴性对照品、阳性对照品、样品标准品等； 3.规划实验中所使用各种试剂的浓度、加入量、反应时间等； 4.再细化实验中每个步骤的开展时间，合理的时间安排能使实验有条不絮的进行。 第二：实验准备 1.实验所使用物料的清点； 2.实验试剂的配备； 3.实验仪器的预约； 第三：实验操作（以双抗体夹心法为例） 1.包被（在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体，使之与板结合） 4℃过夜（大于12小时）或37℃孵育2小时，包被后洗涤一次； 2.封闭（一般使用0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等）37℃反应2小时（封闭液体积要大于包被液体积），封闭后清洗3次； 3.加入含有待测抗原的样品，37℃孵育1小时； 4.洗涤，清洗3次； 5.加入酶标液（酶标二抗），37℃孵育1小时； 6.洗涤，清洗5次； 7.加入酶促反应底物，发生显色反应（37℃避光显色5~15min)，终止显色后测量450/630nm吸光值。 注：上面实验共12次清洗，清洗次数可适当增多，同一反应尽量保证使用同一种清洗液，常见清洗液有PBST、TBST、PBS等。 结果判定 定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性，N为阴性对照孔。 定量测定 实验中使用的试剂、仪器 常用试剂： 1.包被缓冲液：0.05M PH 9.6 碳酸盐缓冲液、0.1M PH 9.6 碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL 缓冲液等。 2.封闭液：0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等（一般溶于0.15M PBS中）。 3.洗涤液：PBS、PBST、TBST等