生物大分子的制与纯化.pptVIP

透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。 透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜、透析管。 截留分子量（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量）。 商品透析袋制成管状，扁平宽度为23 mm～50 mm。为防干裂，用10％的甘油处理过，含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前须除去。 可先用2%碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA溶液煮沸10min，再用蒸馏水煮沸，冷却后漂洗。处理后的透析袋可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3。 使用时，通常要留三分之一至一半的空间。 透析体积比、时间 1:10 3hr 1:20 O/N 脱盐效果检查 检查透析效果的方法是：用1％BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％AgNO3检查NaCl、KCl等。 有机溶剂沉淀法 ⑴ 基本原理 有机溶剂沉淀法的优点是： 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其它溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。 有机溶剂的浓度和体积可按下式计算： V = V0 (S2－S1)/(100－S2) 式中：V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度 100是指加入的有机溶剂浓度为100％，如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式的(100－S2) 项应改为 (95－S2) 。 选择性变性沉淀法 利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。 ⑴ 热变性 ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性 ⑶ 选择性酸碱变性 酵母干粉中加0.066mol/L磷酸氢二钠溶液 ↓ 37℃水浴保温2h ↓ 室温搅拌3h ↓ 离心收集上清液 ↓ 升温至55℃，保持20min后迅速冷却 ↓ 离心去除热变性蛋白 ↓ 为热稳定的醇脱氢酶溶液(上清液） 等电点沉淀法 有机聚合物沉淀法 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG ) 。在一定范围内，高分子量和浓度高的PEG沉淀的效率高。 优点： ① 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 ② 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 ③ 沉淀后有机聚合物容易去除。 超滤 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。 广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。  超滤工作原理示意图。 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。 微孔过滤所用的操作压通常小于4×104 Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。 超滤所用操作压为4×104 Pa～7×105 Pa，膜的平均孔径为10～100埃，用于分离大分子溶质。 反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105 Pa～140×105 Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。 超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。 在生