基于几丁质酶阻断的生物活性物质的筛选-生物化工专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ．金罡王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：刘碱釉 签字日期： 弘fJ年妒≥。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金目曼工些太堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权金月曼王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：剐嗍牺 导师签名：弓钒1譬j叭。导师签名：弓铷K』V＼ 签字日期： 弘Jf年中月弓oft 签字日期：加1『年歹月午El 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 基于几丁质酶阻断的生物活性物质的筛选 基于几丁质酶阻断的生物活性物质的筛选 摘要 几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用，该酶本身及其 酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。 论文首先分别从蚕蛹和棉铃虫蛹体内提取几丁质粗酶，经过硫酸铵分级沉 淀和Sephadex G．150分离得到几丁质酶。用SDS．PAGEi贝0得两酶的分子量分别为 88kDa、75kDa；水解胶体几丁质的Km值分别为22．3pmol／L、41．09mol／L：酶反 应的最适温度分别为45℃和50。C，最适pH值均为6．0；高浓度的Mn2+对两酶均 有较强的激活作用，而Cu2+、SDS对两酶都有较强的抑制作用；两酶对所选用 的真菌均有抑制作用。 以棉铃虫蛹几丁质酶作为筛选靶标，通过平板透明圈法和DNS比色法进 行几丁质酶抑制剂的筛选，从全国各地共34份土样中筛选出以A0901“菌株为 代表的具有几丁质酶抑制性的活性菌株33株。 对33株活性菌株发酵液中的活性物质成分的分离纯化技术进行初步探 索，比较系统地研究了A09014菌株活性物质的分离纯化。采用活性追踪的方法 对其进行分离，通过乙醇沉淀、Sevage试剂除蛋白及Sephadex G．100凝胶色谱 得到一个纯的活性物质，经HPLC检测显示在保留时间l 5min左右为一单峰， DNS比色法验证其抑制率为54．2％，红外、质谱、元素分析确定其为一个多羟 基的化合物。 经形态、培养特征以及16S rDNA序列聚类分析，将菌株A090l撑鉴定为链 霉菌属。并确定其发酵条件为：可溶性淀粉作为碳源，KN03作为氮源，发酵培 养基初始pH值调至6．0，最适温度28℃，接种量为10％，培养时间6d，发酵液抑 制效果最佳。 关键词：几丁质酶抑制剂分离纯化链霉菌 Screening Screening Study of Biological Active Substances with the Inhibition of Chitinase Abstract The importance of chitinases in the physiological and developmental processes of fungus and insects made themselves and their inhibitors important targets for biological pesticides． Chitinases were isolated from Bombyx mori and Helicoverpa armigera and purified to electrophoretic homogeneity by the steps of ammonium sulfate precipitation，Sephadex G-1 50 column chromatography and SDS—PAGE．One band of 88 kDa was observed for Bombyx mori，and the other band of 75 kDa was present in Helicoverpa armigera．Kms of chitinases in silkworm and bollworm were calculated to be 22．3 J_tmol／1 and 41．0}tmol／1，respectively．The experiment proved th