WESTERN BLOT 实验介绍及流程.ppt

仪 器 培 训;Bio-rad垂直电泳、电转装置;电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等 电转移槽 切胶板、黑白夹板、海绵垫等 电泳仪 ;Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。;Western blot 检测蛋白表达实验流程; SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn进一步完善。 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物（电泳样品加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟）。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。 ;1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel. ;SDS电泳操作步骤;;2 Electroblotting transfers the separated proteins from the gel to the surface of a nitrocellulose membrane. ;（1）剥胶 用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶 （2）准备滤纸和硝酸纤维素膜 切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致 （3）浸泡滤纸、膜和海绵垫 用转移液（含甲醇）浸泡，开门通风 （4）制备“三明治” 制备每一层时注意赶气泡 （5）电转 75V，1.5h，在冰浴中进行，黑板对黑极（－），白板对白极（＋）;4 An antibody that is specific for the protein of interest (the primary antibody - Ab1) is added to the nitrocellulose sheet and reacts with the antigen.? Only the band containing the protein of interest binds the antibody, forming a layer of antibody molecules ;5 Following several rinses for removal of non-specifically bound Ab1, the Ab1-antigen complex on the nitrocellulose sheet is incubated with a second antibody (Ab2), which specifically recognizes? the Fc domain of the primary antibody and binds it. Ab2 is radioactively labeled, or is covalently linked to a reporter enzyme, which allows to visualize the protein-Ab1-Ab2 complex .;Western blot 实验流程;Western blot 实验结果与分析;考核题目;Thank you very much!(第三部分完)