细菌检验基本技术难培养细菌的分离.docx

细菌检验基本技术：难培养细菌的分离 　　在细菌分离中经常会遇到各种各样的难培养细菌，主要包括以下几种类型： 　　营养要求高（或培养基中需要添加特定成分）：这类细菌在一般的增菌培养基和普通平板（包括血平板）中往往不能被分离成功，如支原体的培养等。 　　需要特殊的温度、湿度、ｐＨ和气体条件：许多细菌（如螺杆菌属的细菌和弯曲菌属的细菌等）只能在微氧环境下生长，有些（如类杆菌属和梭杆菌属的细菌等）则只能在厌氧环境中生长，普通需氧培养条件下无法分离成功。 　　生长特别缓慢：在１８～２４小时内无大量细菌生长繁殖，也无法在短时间内形成肉眼可见的菌落，需要数天或数周的培养时间，在从临床样本中分离此类细菌时，培养过程中防止杂菌的污染和过度生长的难度较大。 　　对于这种类型的细菌，常需要特殊的分离手段。 　　（一）厌氧菌分离 　　厌氧菌的培养必须在厌氧培养箱中隔绝氧气进行，必要时充以惰性气体。必须在简陋条件下进行时，可利用烛缸：将培养基置于一个可密闭的容器内，并在容器中点燃一支蜡烛，密闭，并置培养箱中培养。燃烧的蜡烛耗尽容器中的氧，并产生二氧化碳，以满足厌氧细菌生长的条件。 　　严格的厌氧菌的分离操作，从处理标本开始都需要在无氧的手套箱内进行。 　　（二）支原体分离 　　支原体没有细胞壁，通常有特殊的营养要求，可以像经典的细菌分离一样地分离支原体，但需要使用特殊的培养基。培养基的添加剂中应包括胆固醇、马血清、酵母提取物、抗生素等，液体培养基中还要添加酚红做显色指示剂。 　　接种固体培养基后置５％ＣＯ２条件下３７℃培育，注意环境湿度，７日后可用６０倍低倍镜选用斜投射光观察是否有菌落生长。支原体生长缓慢，一般在固体培养基３周左右长成菌落，菌落中心一般陷入平皿生长，典型菌落呈“油煎蛋”状。 　　由于支原体的菌落坚实，用取菌环无法挑取，分纯时可用灭菌刀片切取菌落琼脂块，移入液体培养基中压碎琼脂块进行培养。培养基由棕红色变为黄绿色提示生长。由于支原体比普通细菌小，液体培养不会产生明显浑浊，如明显浑浊提示可能有污染。待支原体生长繁殖，稀释培养物再接种固体培养基，使形成分散单个菌落，切取单个菌落再移入液体培养基，反复２～３次，即可得支原体纯种。 　　（三）Ｌ型分离 Ｌ型为细胞壁缺损的细菌，许多致病细菌都能转化为Ｌ型，由于不能在普通培养基上生长而难于分离。在普通的渗透压下，细胞壁缺损的细菌会因“胀破”死亡，因而，分离Ｌ型的培养基必须具有高渗透压。通常使用琼脂浓度０．５以下的半固体培养基，加马血清及１０％蔗糖以维持渗透压。在这种培养基上，细菌的Ｌ型可生长成“油煎蛋”样的细小菌落。有些Ｌ型的细菌可以恢复，恢复后即可按正常方法培养。 （四）螺旋体分离 螺旋体通常不能在固体培养基上长成单个菌落，分离时需要专门的方法。 １．钩端螺旋体分离 从无杂菌污染的标本，如早期病人的血液标本中分离钩端螺旋体时，应接种专用的培养基如Ｋｏｒｔｈｏｆ或ＥＭＪＨ培养管中，置２０～３０℃培养。每隔５～７天取培养物暗视野显微镜下观察有无钩端螺旋体生长，若有生长，即接种于新鲜培养基中，可得钩端螺旋体的纯培养。若未见生长，需继续培养６０天，仍不见钩端螺旋体方作阴性处理。 　　可能有杂菌污染的标本，如病人尿液，可在采集尿标本的前一天晚上给病人服碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２～４ｇ，同时，在培养基中加入１００～４００μｇ／ｍｌ　５氟脲嘧啶或１／２０００的磺胺嘧啶。 环境水样检测时，为克服杂菌生长，将３ｍｌ水样注射到豚鼠腹腔，４ｈ后取心血作培养，四周后人工处死，取血液、肾和脑作血清学试验和培养。 ２．梅毒螺旋体分离 梅毒螺旋体在人工培养基上不易生长，可接种在兔睾丸或眼前房内繁殖。目前研究表明，梅毒螺旋体并不是严格的厌氧菌，在氧浓度为１．５％条件下，接种到含有棉尾兔上皮细胞的组织培养基上可有一定程度繁殖，其最适合培养温度为３４～３５℃。 （五）立克次体分离 立克次体是专性细胞内寄生菌，人工培养基不生长，必须通过动物及细胞分离。 １．通过动物 在广义立克次体中，除恙虫病选小白鼠外，其他立克次体均选用雄性豚鼠分离。将标本经腹腔接踵动物。逐日观察体温，动物有发病表现时，解剖进行腹壁刮片及肝、脾印片姬姆尼茨或姬姆萨染色检查以及ＰＣＲ检测。阳性时，保存含有立克次体的脏器。 ２．使用鸡胚分离 取５～７日龄鸡胚，气室向上，常规碘酒及酒精消毒，用打孔器在蛋壳上打孔，以无菌注射器将接种材料注入鸡胚卵黄囊，石蜡封孔。３７℃孵箱孵育。逐日观察鸡胚存活情况。接种后４～５天死亡者，姬姆尼茨、姬姆萨或荧光染色镜检发现立克次体，保存卵黄囊。 　　３．细胞培养 　　立克次体常用的敏感细胞是Ｖｅｒｏ及Ｌ９２９细胞。按常规细胞培