《临床免疫学和免疫检验》讲义教案沉淀反应.docVIP

第六章沉淀反应 第一节沉淀反应的特点 沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。 沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。 沉淀反应分两个阶段： 第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，儿秒到儿I?秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见。 第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需儿十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。 第二节液体内沉淀试验 一、 絮状沉淀试验 抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接彩响, 因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。 （一） 抗原稀释法 （二） 抗体稀释法 （三） 方阵滴定法 抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。 抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。 方阵滴定法即棋盘滴定法 二、 免疫浊度测定 免疫浊度测定本质上属于液体内沉淀反应。 将现代光学测量仪器与口动化检测系统相结合应用于沉淀反应。 可进行液体屮微蜃抗原、抗体及小分了半抗原定罐检测。 （一）免疫比浊测定的影响因素 1、 抗原抗体的比例 抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素，当抗原和抗体的比例适当时，二者全部结合，既无过剩的抗 原，也无过剩的抗体。 当反应液屮抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是 经典的海德堡曲线理论。 当抗原过虽时，形成的10 （免疫复合物）分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减 少，这就是高剂量钩状效应。 2、 抗体的质量 免疫比浊测定法要求抗体的特升性强、效价鬲、亲和力强，并使用R型抗体。 3、 抗原抗体反应的溶液 抗原抗体反应液的最适pH为6. 5? 5。 一般常使川磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。 4、 增浊剂 某些非离子型亲水剂对促进1C的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20 其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形 成大分子复合物。 （二）抗体稀释法 1、 透射免疫比浊法。 2、 散射免疫比浊法。 3、 免疫胶乳比浊法。 第三节 凝胶内沉淀试验 凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例 恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环 凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚内烯酰胺凝胶等 一、 单向扩散试验 单向扩散试验是在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则 形成沉淀环。 （一） 试管法 将一定最的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液，使待测抗原在凝胶中白由 扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。 （二） 平板法 将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37°C 让其自由扩散，24?48小时后可见孔周围岀现沉淀环，测定环的胃径或而积计算标木屮待测抗原的浓度。 K Mancini曲线 适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小吋）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度 呈线性关系。 2、Fahey |11|线适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数值画线,浓度对数与扩散环直 径呈线性关系。 （三） 影响因素 1、 抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。 2、 每次测定都必须作标准曲线。 3、 每次测定时必须川质控血清作质控。 4、 注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。 5、 皿用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。 二、 双向扩散试验 双向扩散试验是让抗原和抗体双方都在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成抗原抗体沉淀线, 观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。 （一） 试管法 先在试管屮加入含有抗体的琼脂，凝固后在屮间加一层普通琼脂，冷却后再将抗原溶液加到上层，放 置后，下层的抗体和上层的抗原向中间琼脂层内自由扩散，在抗原抗体浓度比例恰当处形成沉淀线。 （二） 平板法 是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法z—。 先在平板玻璃上倾注一均匀的琼脂薄层，凝固后在琼脂板上打孔，在相对的孔屮加入抗原或抗体，放 置湿盒37°C 18?24小时麻，琼脂屮各白扩散的抗原和相对应的抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀 线。 1、 抗原或抗体的存在与否以及和对含量的估计 沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线如果靠近抗原孔，则衣示抗体含量较人 沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大。 不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗原或者抗原过量。 2、 抗原或抗体相对分子量的分析 抗原或抗体在琼脂内自山扩散，英速度受分子量的影响。 分了虽小者扩散快，反Z则较慢。