建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的细胞分子生物学和免疫学研究-遗传学专业论文.docxVIP

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本研究做过贡 献的老师和同学均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 日期： 关于论文使用授权说明 本人完全了解杭州师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他手 段保存论文。 日期： Study of Molecular Cell Biology and Immunology of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus A Dissertation for Master’s Degree Submitted to The Graduate School, Hangzhou Normal University Hangzhou, Zhejiang, CHINA Graduate student: Xu Ying Supervisor: Professor Shi Nong-nong Major: Genetics April 2008 课题来源： 植物病毒检测试剂盒及抗病毒疫苗研发（2006C32016），浙 江省科技计划项目 分子标记及脱毒快繁技术在重要花卉植物中的应用 （2005132H06），杭州市科技局重点实验室创新基金 目 录 HYPERLINK \l _bookmark0 目 录 5 摘要……………………………………………………………………………….……5 ABSTRACT…………………………………………………………………………..6 第一章 兰科植物病毒生物学研究进展…………………………………………….8 1 兰科植物病毒简介 8 1.1 主要兰科植物病毒概述8 1.2 兰科植物病毒的传播方式及地区间差异10 1.3 建兰花叶病毒……………………………………………………..…….10 1.4 齿兰环斑病毒……………………………………………………………11 1.5 建兰环斑病毒………………………………………………………..12 2 常用兰科植物病毒检测方法13 2.1 症状观察及指示植物接种法 .13 2.2 电子显微镜技术14 2.3 血清学方法14 2.4 分子生物学方法15 3 抗病毒基因工程研究进展17 3.1 脱毒快繁17 3.2 卫星RNA研究 21 3.3 D I RNA研究………………………………………………………… 21 3.4 RNA沉默研究…………………………………………………………. 22 3.5 转基因研究23 4 展望 错误！未定义书签。 目录 目录 第 第 PAGE 10 页 共 81 页 第二章 感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的兰花超微结构病变研究26 1 材料和方法错误！ 未定义书签。6 1.1 材料错 误！未定义书签。6 1.2 试剂 错误！未定义书签。6 1.3 方法 26 1.3.1 负染电镜观察27 1.3.2 透射电镜观察27 透射电镜样品包埋制备27 样品的超薄切片27 切片的染色28 超薄切片的电镜观察28 2 结 果28 2.1 病毒粒子形态观察 28 2.2 细胞内病毒聚集体观察28 2.3 细胞超微结构病变观察32 3 讨 论35 3.1 病毒晶体结构 35 3.2 病毒长距离运输 35 3.3 叶绿体病变 36 3.4 线粒体增生 36 3.5 核质变化 36 第三章 建兰花叶病毒与齿兰环斑病毒的分子鉴定37 1 材料与方法 37 1.1 材料 37 1.2 分子生物学试剂 38 1.3 引物设计 38 1.4 方法 38 1.4.1 植物总RNA的提取 38 1.4.2 复合RT-PCR 39 1..4.2.1 cDNA第一链转录 39 MPCR反应体系 39 1.4.3 单链构象多态性分析（PCR-SSCP） 40 2 结 果 40 2.1 CYMMV和ORSV CP基因的普通RT-PCR扩增 40 CYMMV和ORSV CP基因的多重RT-PCR扩增 41 CymMV和ORSV CP基因的PCR-SSCP鉴定 42 2.4 蝴蝶兰杭州分离物 CymMV和ORSV CP基因的多重RT-PCR鉴定 43 2.5 序列鉴定和同源性分析44 3 讨 论 46 第四章 建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因原核表达及多克隆抗体制备 .48 1 材料与方法 48 1.1 材料 48 1.1.1 菌株、载体与试验动物49 1.1.2 分子生物学