建立LCM分离精子细胞的DNA检测方法及其法医学应用-法医学专业论文.docxVIP

I I 建立 LCM 分离精子细胞的 DNA 检测方法 及其法医学应用 中文摘要 目的 为了提高混合斑中精子细胞的检测成功率，建立一种能够有效分离混合斑 中少量精子细胞并获得单一男性 DNA 分型的分离检测方法十分必要。本课题旨 在建立一种用激光捕获显微切割技术（ LCM）分离精子细胞的 DNA 检测方法； 用建立的方法对 5 个个体的精子 DNA 进行检测，以比较这种方法在 5 个个体间 是否有差异；并用建立的方法对低拷贝数进行检测；对利用 LCM 分离不同比例 混合斑中的精子细胞并检测得到单一男性分型的能力进行评估，以期让 LCM 在 强奸案件中发挥重大的作用。 方法 用 LCM 捕获同一个体的精子细胞，分为两组，分别用两种染色剂（苏木 素和四碘荧光红）染色，提取和扩增方法一致，捕获 400 个精子细胞，每组进行 3 次平行试验，对两种染色剂染色的精子细胞的基因座检出率进行比较，选择一 种对精子细胞 DNA 检测影响小的染色剂；用 LCM 捕获苏木素染色的同一个体 的精子细胞，分为 3 组 ，各 400 个精子细胞，分别用三种不同的试剂盒（DNA IQTM System，QIAamp○R Mini Extraction Kit 和 PicopureTM DNA Extraction Kit）对精 子细胞进行提取，进行同样条件的扩增，每种提取方法进行 3 次平行实验，通过 比较基因座检出率来选择一种能够有效提取 LCM 分离的精子细胞 DNA 的提取 方法；用 LCM 捕获 5 个不同个体的精子细胞各 400 个，用建立的染色方法和提 取方法及同一种扩增条件对精子 DNA 进行检测，比较用建立的方法检测 5 个不 同个体是否有差异；把标准 9947A 稀释成 0.1ng?μL、0.075 ng?μL、0.05ng?μL、 0.025ng?μL、0.01ng?μL，分别用 28、30、32、34 个扩增循环数进行扩增，得出适 合低拷贝数 DNA 的扩增循环数；利用建立的适合 LCM 分离精子细胞的染色和 提取方法，并增加循环数到 34 个循环，对 30、20、10、5、4、3 个精子细胞进 行检测；人为配制 9 个不同比例的精子细胞 -阴道上皮细胞混合液，并涂于玻片 上，用 LCM 分离玻片上混合斑中的精子细胞（数量均少于 200 个）并进行 DN A 检测，得出检出率，以评价 LCM 技术方法在分离混合斑中少量精子细胞并得到 单一男性分型的能力。 结果 苏木素染色后和四碘荧光红染色后的基因座检出率之间的差异明显具有统 II II 计学意义，用苏木素染色的精子细胞提取后可得到全部的基因座分型，而四碘荧 光红染色的精子细胞未得到任何分型；在 3 种试剂盒的 DNA 提取方法中，DN A IQTM System 试剂盒的提取效果最好；比较检测的 5 个个体之间的精子细胞 DNA- STR 基因座检出率，统计学分析用这种方法检测 5 个个体精子细胞 DNA 的基因 座检出率无明显差异；用建立的方法对低拷贝数进行检测，30、20、10、4 个精 子细胞可得到全部基因座分型，5 个精子细胞有丢失等位基因现象，3 个精子细 胞有丢失等位基因和非特性扩增的现象；用 LCM 捕获 9 个不同比例的混合斑中 的精子细胞（数量均﹤200 个）并进行 DNA 检测，其检出率为 88.9﹪，且均为 单一的男性分型。最后将建立的 LCM 技术方法应用于实际案例，并取得成功。 结论 本研究成功建立了一种适合激光捕获显微切割技术（LCM）分离精子细胞 的细胞染色方法和 DNA 提取方法，并评价了 LCM 分离混合斑中精子细胞并检 测得到单一男性分型的能力，为 LCM 技术在法医学实际案例中的应用提供了方 法学基础。 关键词 法医物证学；精子；混合斑；激光捕获显微切割技术（ LCM）； 低 拷 贝 数；短串联重复序列 Establishing the DNA testing method of sperm separated by PAGE PAGE III laser capture microdissection and its application in the forensic Abst ract Objective To improve the ability of a technology that can separate the sperm from the mixed cells,it′s necessary to set up a met hod which can effectively separate few sperms from mixed cells,a nd can obtain a single ma le