建立差异磷酸化蛋白质组学技术平台分析EB病毒瘤蛋白LMP1介导的信号转导通路-病理学与病理生理学肿瘤专业论文.docxVIP

中文摘要摘要 中文摘要 摘要 EB病毒与多种肿瘤的发生发展密切相关，作为一个外界环境致 病因子，对其基因组功能分析发现其编码的潜伏膜蛋白1(1atent membralle口rotein 1，LMPl)是～个重要的瘤蛋白。在LMPl的羧基 末端存在三个功能性结构域CTARl、C1AR2和CTAR3，它们通过募 集信号衔接分子TRAFs、TR ADD和JAK3异常激活NF K B、AP．1 和SL盯三条信号转导通路。激活的转录因子Ⅻ7 K B、AP．1和Sn盯 进而调节下游靶基因EGFR、cyclm D1、MMP9、sun，ivin等的表达， 同时也通过某种机制调节一些下游蛋白的磷酸化。但是，受LMPl 调节的信号分子和下游功能效应蛋白质分子还远远没有得到阐明，并 且可能还存在未证实的由Lml介导的新的信号转导通路。 我们前期在鼻咽癌细胞中所研究的LMPl异常激活NFx B、AP—l、 JAK／sTAT信号转导通路，主要借鉴在B细胞中的研究模式。可是， 上皮来源的鼻咽癌细胞与B细胞存在组织类型差异，因此，EB病毒 编码的瘤蛋白LMPl与宿主细胞内基因的相互作用以及介导的信号转 导通路也就可能存在差异。 细胞内信号转导通路网络错综复杂，传统的信号转导通路研究策 略主要针对单条信号转导通路以及其中的单个信号转导分子，存在一 定的局限性。随着蛋白质组学研究方法引入信号转导通路研究中，产 生了一个新的研究领域一一信号转导蛋白质组学，简称为信号组学 (signalomics)。 基于信号转导分子大多数是低丰度蛋白质，用传统的蛋白质组学 研究策略时，高丰度蛋白质往往掩盖了低丰度蛋白质，使之很难分离 得到，但低丰度蛋白质又往往是功能效应蛋白质分子，具有重要的生 物学意义；并且在信号转导过程中大多数信号转导分子需要不同程度 的磷酸化(主要是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化)而将信号逐步传 递下去，因此从总蛋白质中单独分离出磷酸化蛋白质，显得极其重要。 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 为此，我们借助磷酸化蛋白质体内外富集策略，结合蛋白质组学 高通量技术，鉴定受LMPl调控的下游功能效应蛋白质分子(磷酸化 蛋白质分子)；然后采用传统的信号转导通路研究策略建立髓病毒瘤 蛋白LMPl与下游功能效应蛋白质分子间的关系，初步构建雎病毒瘤 蛋白LMPl介导的信号转导通路网络。 我们拟采用磷酸酶抑制剂和磷酸基团金属亲和纯化(phosphate metal affinity chromatograph yJ PMAC)两种策略来富集磷酸化蛋 白质。我们研究证实采用磷酸酶抑制剂抑制细胞内磷酸酶活性可以有 效提高细胞内磷酸化蛋白质的总量，并且呈剂量和时间依赖性，从而 确定了丝／苏氨酸磷酸酶抑制剂和酪氨酸磷酸酶抑制剂的最佳工作浓 度和最佳处理时间。同时采用PMAc技术从细胞总蛋白质中分离纯化 出磷酸化蛋白质。我们以p—EGFR，p—p65和Q—tubulin分别作为磷 酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质的代表，检测细胞总蛋白经过PMAC处 理后磷酸化蛋白质组分中是否存在非磷酸化蛋白质，和非磷酸化蛋白 质组分中是否存在磷酸化蛋白质，结果显示，磷酸化蛋白质组分中不 存在Q—tubulin，非磷酸化蛋白质中不存在p—EGFR和p—p65，说明 借助PMAC策略可以有效地分离磷酸化蛋白质与非磷酸化蛋白质。从 而建立了磷酸化蛋白质体内外富集技术平台。 在已经建立磷酸化蛋白质富集技术平台的基础上，我们确定了磷 酸化蛋白质富集结合蛋白质组学技术鉴定LMPl调节的磷酸化蛋白质 分子的可行性。我们用磷酸化蛋白质的总量计算、二维凝胶电泳以及 单个磷酸化蛋白质的western blot分析发现，CNEl和cNE卜LMPl细 胞经磷酸酶抑制剂处理后，抑制了LMPl介导的下游蛋白质磷酸化事 件，导致两细胞中磷酸化蛋白质的均一性。所以我们只好放弃磷酸酶 抑制剂这种磷酸化蛋白质富集策略，而只采用磷酸化蛋白质体外富集 策略：PMAC技术。 当细胞不经过磷酸酶抑制剂处理，而直接用PMAC技术从细胞总 蛋白中分离纯化出磷酸化蛋白质。磷酸化蛋白质总量计算显示，EB 病毒瘤蛋白LMPl可以增加细胞内磷酸化蛋白质总量的18．03％，差异 非常显著(卢O．00845)。通过分析富集的总磷酸化蛋白质中的单个磷 Il 博土学位论文 博土学位论文 中文摘要 酸化蛋白质的变化也发现，富集的磷酸化蛋白质中单个磷酸化蛋白质 p～EG