化妆品添加物白杨素之保肝功效-建国科技大学.DOC

評估化妝品添加物白楊素抗氧化性傷害之功效 高而仕1 趙佩玉2 邱永偉3 丁韋仁4 黃俊銘4,* 1. 建國科技大學美容系 2. 國立勤益科技大學休閒產業管理系 3. 中山醫學大學附設醫院急診部 4. 中山醫學大學應用化學系 摘要 白楊素(chrysin)是類黃酮(flavonoids)的其中一種，可以自西番蓮花(Passion flower)中萃取而得。由於類黃酮具有一定的抗氧化、抗發炎能力，因此白楊素常被添加於化妝品、保養品中使用。本研究即以初代鼠肝細胞為實驗模組，評估白楊素的保護初代培養鼠肝細胞避免氧化性傷害的能力，結果發現暴露於t-BHP(tert-butyl hydroperoxide, 1.5mM, 30min)的初代鼠肝細胞即會死亡超過50%，而預先經白楊素(10μM)處理15小時後的初代鼠肝細胞暴露於t-BHP(1.5mM, 30min)則沒有死亡。經HPLC分析白楊素在培養基中含量以追蹤其被初代培養鼠肝細胞所代謝的情況，發現15小時後白楊素(10μM)均以被初代培養鼠肝細胞所代謝耗盡。總合以上結果推論，白楊素(10μM)可以充分的被初代培養鼠肝細胞所吸收使用，並且保護初代培養鼠肝細胞避免經由t-BHP 關鍵字: 白楊素、初代培養鼠肝細胞、氧化性傷害。 研究背景與目的 類黃酮(flavonoids)具有抗氧化、抗發炎等生物活性[1]。萃取自西番蓮花(Passion flower)的白楊素(chrysin)亦是類黃酮的一種，由於價格便宜、萃取容易，因此常被添加在化妝品、保養品之中使用。有關於類黃酮抗氧化力與其結構的關係，根據前人的研究指出，具有良好的抗氧化力必需具備有下列條件[2,3]： (1) C環上第2與第3位置的碳與碳之間具有雙鍵。 (2) C環上第3號位置的碳上要有羥取代基(hydroxyl group)。 (3) B環上要有羥取代基(hydroxyl group)。 而白楊素在結構上不具備有上述條件，因此本研究即利用初代培養鼠肝細胞進行測試，藉此評估白楊素保護初代培養鼠肝細胞避免經由t-BHP(tert-butyl hydroperoxide)所造成的氧化性傷害的能力。 實驗項目與方法 一、t-BHP誘導大白鼠初代培養肝細胞(Primary culture hepatocyte)損傷之作用 本實驗使用購自樂斯科生物科技股份有限公司Wistar品系，體重250公克之雄性大白鼠為實驗動物。初代培養之肝細胞係根據Bonney氏等之方法[4]，以肝臟灌流方式(Perfusion)取得。在大白鼠腹腔注射0.5ml的戊基巴比妥鈉鹽溶液(Pentobarbital, 50mg/ml)，待藥效作用使大白鼠麻醉後，將大白鼠固定後由下腹部剪開至腹部上緣劍突。將不含鈣、鎂離子HBSS(Hank’s balanced salt solution)緩衝溶液150ml預先加熱至38℃。將蠕動幫浦裝置與20G靜脈滯留針組合好，穿刺肝門靜脈後用膠帶固定，剪斷下腔靜脈並打開蠕動幫浦開始灌流。當加有EDTA，不含鈣、鎂離子HBSS緩衝溶液已使用約100ml時，肝臟內血液大多已被置換。關閉幫浦，並且以止血鉗夾住下腔靜脈。將100mg膠原蛋白分解酶(Collagenase IV)取出倒入已預熱至38℃，含有鈣、鎂離子之HBSS緩衝溶液100ml中溶解。繼續剪開大白鼠胸腔，並剪碎心肺，同時打開幫浦繼續進行灌流。當含有膠原蛋白分解酶之HBSS溶液灌流已使用約80ml時肝臟細胞間隙變大。降低轉速，直至肝臟已經呈現水球狀時停止灌流。小心取出肝臟放置培養皿中，將肝臟剪碎，加入10ml的William E培養基，並用篩網(200 mash)過篩至燒杯中，再取10ml William E培養基，沖洗培養皿與篩網上的碎片，然後將肝細胞溶液裝入1支50ml離心試管，以530rpm轉速離心10分鐘，抽去上層液，然後以William E培養基將下層細胞溶液稀釋至30ml，再加入2ml的10倍濃度之含有鈣、鎂離子之HBSS緩衝溶液，再加入18ml的Percoll溶液，混合均勻後以530rpm轉速離心10分鐘。抽去上層溶液，留下層細胞溶液，再以William E培養基稀釋至50ml後以rpm轉速離心10分鐘，抽去上層溶液。最後以William E培養基稀釋至50ml後以血球計數板計算肝細胞數目。將細胞以每毫升1×105之細胞密度培養於培養皿並置於培養箱中培養。經過4小時貼壁後確認細胞狀況，選取貼壁平均且無汙染的培養皿來進行實驗。將t-BHP水溶液先以William E培養基稀釋至1.5 mM等濃度後，將細胞分別浸泡在t-BHP的時間控制為0、15、30、60分鐘後，然後移除含有t-BHP的培養基，並用PBS溶液清洗。接著更換William E培養基之後，