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细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24 孔板，transwell 小室（8µm，24 孔板专用），ECM Gel，10%FBS+ 培养基，无血清培养基，10 µ、200 µL、1000 µL 移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组 （上下层均没有趋化因素），实验组 （按照实验需 要，上层或者下层加入趋化因素），对照组 （趋化因素与实验组中的相反）。如果 有特别需要，可以再加上阳性组 （上下层都有趋化因素）。 实验操作 （请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1. ECM Gel 原液提前1 h 放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2. 将1.5 mL EP、枪头盒、transwell 放在24 孔板里面后，置于冰上预冷。 3. 根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5 在冰上稀释成使 用液。 4. 把枪头剪去一小段（约3 µm）后在冰上吸取40 µL/孔ECM Gel 使用液轻轻 加入transwell 上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5. 放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 4 6. 消化、离心、计数细胞后，按照2.5x10 / mL 用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液 （如果细胞很多，这一步可以提前，在4 、5 之前做）。 7. 按照每孔200 µL，将细胞悬液加入transwell 上室，同时在transwell 下室加 入10%FBS+培养基500 µL，放入37 ℃孵箱培养。 8. 若干小时后取出，吸去transwell 上室多余液体，用PBS 清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9. 在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10. 在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell 小孔倒置放在上面，拍照。 11. 在100 倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。 1 - 4 12. 清洗transwell ，可以反复使用。 二、细胞侵袭实验 细胞迁移实验不需要ECM Gel 包被，其余步骤一致。 实验原理： 多孔膜是聚碳酸酯膜 （polycarbonate membrane ），膜带有 微孔，孔径大小有0.1 －12.0 µm。 将Transwell 小室放入对应的培养 板中，小室内称上室，培养板内称下 室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯 膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可 以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等 的影响。 细胞迁移和侵袭实验常用8.0µm 膜，上室种肿瘤细胞， 下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养 成分高的下室运动，从而从多孔膜一侧穿过，贴壁于多孔 膜的另一侧，计数其细胞量可反映肿瘤细胞的迁移或者侵 袭能力 （圆形透明小孔为微孔）。 （注：迁移和侵袭是两个概念，迁移是指细胞的运动能力，而侵袭是细胞在运动 的同时会分泌出消化ECM 的蛋白，清除运动障碍，这个实验更能模拟人体内环 境） 注意事项 1. ECM Gel （货号：E1270）由Sigma 公司生产，来源于大鼠肉瘤的细胞外基 质提取物，保存在-20℃，由于在室温中会快速凝固，不可逆，因此需要在 冰上溶解和操作，同时一切要与ECM Gel 接触的耗材也需要预冷，避免俩