甲状腺功能亢进性周期性麻痹患者NKCC1基因及肾素基因的5’端序列分析-内分泌专业论文.docxVIP

郑州大学2007届硕卜研究生学位论文 郑州大学2007届硕卜研究生学位论文 甲状腺功能亢进性崩期性麻痹患者NKCCI基因及肾素基因 Elements，XRE)而发挥作用，甲状腺激素反应元件由两个半单位组成，各结合一 个受体单体。每个半位一般长6 bp，其共有序列为AGGTCA。由于TPP的发作 和缓解与甲状腺功能密切相关：即甲亢时麻痹发作而甲状腺功能正常后大多数患 者发作停止。因而我们推测TPP的发病可能与二种因素有关：1．钾离子进入细胞 相关的基因及调节基因盼启动子区域核苷酸突变，使TRE对甲状腺激素的反应 增强，功能亢进，钾离子向细胞内转移增加，发生低钾血症，待甲状腺功能正常后 低血钾发作停止。2．细胞钾离子外流相关的基因突变，使该基因功能减退，钾外 流减少。如家族性周期性麻痹发病机理。本研究着眼于前者：即对钾离子进入细 胞相关基因及调节基因的启动子区域核苷酸序列的分析。我们选NKCCl基因和 肾素基因的5’区域核苷酸序列为我们研究的候选基因。通过研究TPP患者 NKCCI基因和肾素基因5’端区域内邻近甲状腺激素反应元件部分有无有意义的 突变和SNP，探讨TPP患者是否存在NKCCl基因和肾素基因突变。 材料和方法 1．研究对象：2003年6月．2006年5月在郑州大学第一附属医院内分泌科就 诊的甲状腺功能亢进无周期性麻痹患者71例(甲亢病程6月或复发的甲亢患 者)；甲状腺功能亢进性周期性麻痹患者56例(初诊的TPP患者及以往有低钾 麻痹史的甲亢患者)及73例正常对照(无甲状腺功能异常，无自身免疫性疾病)。 甲亢的诊断标准是临床表现结合血清FT3和(或)FT4升高，TSH低于正常。 采取研究对象晨空腹抽抗凝血5ml，应用时间分辨免疫发光法测定血清FV3，FT4 和TSH水平，常规生化法测定血电解质。同时通过询问病史或查阅病历获得56 例TPP患者和71例单纯甲状腺功能亢进患者的临床特征。 2．基因组DNA的提取：应用经典的苯酚一氯仿一异戊醇抽提法从研究对象 的外周血中提取基因组DNA。 3．拟扩增序列的确定和聚合酶链式反应(PCR)扩增：先利用网上启动子预 测软件(Http：／／www．ucsc．edu／)和反应元件分析软件 (Http：／／www．gene—regulation．com／pub／programs／alibaba2／index．htmi)分析NKCCl及 肾素基因5’端区域核苷酸序列，找出启动子及甲状腺激素反应元件的位点。 NKCCl扩增区域大小为1082bp，位于ATG前2199bp；肾素基因扩增区域大小为 743bp，位于ATG前1238bp。再以基因组DNA为模板，PCR扩增NKCCl基因 II 郑州人学2007届硕十研究生学位论文 郑州人学2007届硕十研究生学位论文 甲状腺功能几进性周期性麻痹患青NKCCl幕}耐及肾索基困 和肾素5’端区域内上述的目的片断。 4．PCR产物的纯化和DNA测序分析：采用Exonucleasel(ExoO和虾碱性磷酸 酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)法纯化PCR产物，并将纯化后的产物直 接于ABB700自动测序仪上测序，应用DNAMAN软件比对分析扩增区域与基 因库中相关序列以发现是否存在与疾病发生相关的有意义的突变。 5．统计学处理：计量资料统计描述采用均数±标准差，用两样本均数t检验 分析，计数资料用率表示，率的差异比较采用∥检验。所有统计数据分析采用 SPSSl0．0统计软件。以P0．05为差异有显著性。 结果 1．目的基因与甲亢周麻发生的关系 甲亢组，甲亢周麻组及正常对照组肾素基因启动子区域内未发现突变及 SNP，NKCCl基因5’端区域内邻近甲状腺激素反应元件部分也未发现有意义的 突变及SNP。 2．甲亢周麻患者与单纯甲亢患者临床特点的比较 单纯甲亢组患者的发病年龄，体重和体重指数以及甲状腺功能与甲亢周麻组 患者相比均无显著性差异；高代谢症候群发生率，甲状腺肿大的发生率和突眼的 发生率都显著高于甲亢周麻组患者，而血清钾浓度显著低于甲亢周麻组患者。 结论 在NKCCl基因和肾素基因5’端序列邻近甲状腺激素反应元件部分没有发现 与甲亢周麻患者发病相关的有意义的突变和SNP存在，甲亢周麻的发病机理有 待我们进一步研究。 关键词甲状腺功能亢进性周期性麻痹NKCCl基因 肾素基因启动子 甲状腺激素反应元件 郑州人学2007届硕l：研究生学位论文 郑州人学2007届硕l：研究生学位论文 甲状腺功能亢进性周期性麻痹患者NKCCl摹冈及肾素基冈 Analyse the 5’Flanking of NKCCI and Renin Gene in Patients with Thy