间充质干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化-神经生物学专业论文.docxVIP

郑，H大学2004年碗士研究生学位论文 郑，H大学2004年碗士研究生学位论文 问充质千细胞的件外培舞及向神经元的诱导分化 间充质干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化 研究生景莹 导师邢莹 郑州大学医学院生理教研室 郑，fl 450052 摘 要 闯充质干细胞(MSC)起源于中胚层，主要位于成体骨谴和入胎儿脐血， 与造血干细胞共存．MSC不仅参与构建造血微环境，发挥支持造血的作用：而 且在动物出生后仍然维持一定程度的自我更新能力，以及具有分化为多种类型细 胞的潜力，属于成体多能干细胞范畴。 自1867年Colmheim首次提出骨髓基质中含有非造血干细胞，以及1976年 Friedenstein用贴壁法粗糙提取出骨髓中该种细胞成分以来，多个实验在含动物 血清的培养基中建立了稳定扩增的骨髓MSC细胞培养体系．2000年，Erices从 入脐血中也分离出MSC，建立起与骨髓MSC类似的髓外来源MSC的细胞培养。 近来研究表明，骨髓和靛外来源的MSC在体内外诱导条件下，不仅能够分化为 骨细胞、软骨细胞、麟肪细胞、腱细胞、肌细胞等中胚层细胞。而且可以跨越胚 层的限制，横向分化riD)为外胚层起源的神经元．MSC向神经元的诱导分化， 有Sanc,hez-Ramos建立的以生长僧养因子为主的模式，和Woodbury建立的有机 诱变；llf(抗氧化剂)为主的方案．诱导后的MSC可检测出nestin，trkA．NSE， NeuN，NF-M，tall等多种神经元胂经干细胞特异性蛋白的表达． 本实验分离及培葬了人脐趣秘兔骨置嚣种来源的MSC，观察细胞的冻存和 复苏，以及贴壁、生长与扩增规律。并使用MTT比色实验绘制不同状态MSC 的生长曲线．采用调整的Woodbury方案，即B嚎基乙醇(BME)低剂量(≤ 3mM)、短对程(≤2h)诱导兔骨髓MSC向神经元分化，并在诱导后继续培养， 免疫细胞化学鉴定诱导分化和分化后培养细胞的阳性率．尝试使用膜片箝全细胞 记录的方法记录诱导前后MSC的钾离子电流的变化。以反映细胞的电生理功能 郑州大学2004年硕士研究生学位论文 郑州大学2004年硕士研究生学位论文 间在耍t塑堕堕体赴堕羞墨塑塑墅墨塑垦曼坌垡 状态。实验数据用··均数”或者“均数士标准差”表示，样本问比较采用方差分析， 检验水准均为a=0．05。 结果显示：1人脐血MSC体外培养呈现细胞的多样性，未形成融合状态， 不能连续多次传代(传代≤3)。兔骨髓MSC在3w左右建立稳定扩增的原代培 养，细胞形态均一，排列有序，体外培养16代以上无变化。2细胞经过多次传 代，MTr比色实验证实生长特性不变(po．05)；冻存后复苏细胞的扩增暂时减 慢，传代后恢复。3向神经元诱导分化后，免疫细胞化学检测结果显示：兔骨髓 MSC表达NSE以及aeztin，其阳性率分别为70％--73％和370／,,-．38％，与对照组 相比有显著差异(po．05)。继续培养，阳性细胞率无明显变化(P0．05)。4诱 导前后的兔骨髓MSC直接贴附于底面或者贴附于赖氨酸处理的底面，一定时段 内，能够与微电极尖端形成离阻封接(giga-sealing)，提示可进行全细胞记录， 为进一步的离子通道的检测提供基础。但目前尚未记录到离子电流的活动。 结论：1．兔骨髓MSC能够建立稳定的连续传代的体外培养，冻存后复苏的 细胞形态和特性不变。人脐血中含MSC，有可能建立同样的培养。2．兔骨髓 MSC经BME诱导可表达n髂如和NSE；诱导后的MSC(神经干细胞／神经元) 在神经培养基继续培养，存活且分子标志韵表达无增减。3．在本实验条件下， 体外培养的兔骨髓MSC诱导前后，均未记录到电流活动。 关键词：间充质干细胞； 体外培养； 诱导分化； 神经元；全细胞记录 郑州大学2004年硕士研究生学位论文 郑州大学2004年硕士研究生学位论文 间充质干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化 Mesenchymal Stem Cell Culture in vitro and Neuron-oriented Induction Postgraduate Jing ying Supervisor Xing ying Department ofPhysiology，Medical college，Zhengzhou University Zhengzhou 450052 Abstraet Mesenehymal stem cell(MSC)，originating from mesoblast,resides mainly in post-natal bone malTOW as well as human umbilical cord blood．and coexists witll hematopoieti