间充质干细胞体外培养方法改良及其诱导调节性树突状细胞的机制-临床医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 不保密 ?。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学硕士学位论文 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的：间充质干细胞是一种具有自我复制和多向分化潜能的干细胞。其在临床 上应用广泛，可用于治疗 GVHD（Graft-versus-host disease）、促进造血重建等。 此外，间充质干细胞还可以抑制异种抗原刺激所致的淋巴细胞反应、促进调节 性 T 细胞生成等，具有广泛的免疫调节作用。并且，近期研究发现，其不但对 特异性免疫应答具有重要的调节作用，对非特异性免疫应答细胞亦具有调节作 用。研究发现，其可能参与“调节性树突状细胞”的形成，但是目前对其作用 机制尚不明确。间充质干细胞已成为干细胞领域研究的重点，具有广阔的应用 前景，但是目前常用的体外培养间充质干细胞的方法容易导致其干性降低、细 胞凋亡以及衰老。因此，本课题拟寻找一种可以维持间充质干细胞干性，降低 其凋亡、延缓衰老进程的培养方法；并对其与树突状细胞之间相互作用的机制 进行初步探讨。 方法：将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养板表面，在 60℃烘箱中完全烘干，形 成壳聚糖薄膜。后将分离出的小鼠骨髓间充质干细胞以同等密度接种于涂覆有 壳聚糖的培养板和普通未经处理的培养板上，培养 5 天后收集两组细胞检测其 干 性 相 关 标 志 分 子 CD44 、 Sca-1 的 表 达 情 况 ； 分 别 用 PI-Annexin V 和 Hochest33342 进行染色和标记，用流式细胞仪和荧光显微镜分析和观察细胞凋 亡的情况；最后用 β-Gal 细胞衰老染色试剂盒进行染色，在光学显微镜下观察 细胞的衰老情况。通过上述实验分析三维球体培养方式对间充质干细胞干性、 凋亡和衰老的影响。为了研究间充质干细胞与树突状细胞之间相互作用的机制， 我们收集生长状态良好的间充质干细胞培养上清，从中分离出外泌体并添加到 树突状细胞的培养基中，通过 ELISA 的方法检测树突状细胞分泌的 IL-10 的情 况。将与外泌体共培养 48h 后的树突状细胞与小鼠淋巴细胞共培养 72h，之后用 流式细胞仪分析淋巴细胞中 CD4+CD25+细胞即调节性 T 细胞的比例以及分析 T 细胞增殖能力的变化。通过对树突状细胞分泌 IL-10 以及其激活 T 细胞能力的变 化进行分析，探讨外泌体是否参与间充质干细胞对树突状细胞的调节。 结果：间充质干细胞在壳聚糖薄膜上培养 1 天即开始出现聚集的趋势，到第 3 天即呈半悬浮的三维球体状态。通过各个实验结果发现：三维球体状态下生长 的间充质干细胞其干性相关分子 CD44 和 Sca-1 的表达比例要明显高于对照组， 很好的保持了其干性；流式细胞仪结果显示的凋亡细胞比例以及在荧光显微镜 I 下观察的凋亡情况表明，三维球体的培养状态很好的延缓了细胞的凋亡；光学 显微镜下观察 β-Gal 染色结果可以看出，对照组细胞明显比三维球体培养的细胞 更早的出现了衰老。将生长状态良好的间充质干细胞分泌的外泌体与树突状细 胞共培养 48h，树突状细胞分泌 IL-10 的量高于对照组；加入外泌体后，树突状 细胞对 T 细胞的激活作用减弱，反而诱导出更多的调节性 T 细胞；并且刺激 T 细胞增殖的能力也有所下降。 结论：间充质干细胞近年来备受关注，目前在组织工程和细胞治疗领域均有广 泛的应用。但在目前的培养条件下容易过早的丧失干性、凋亡和衰老，从而严 重影响其应用价值。我们采用壳聚糖薄膜的方法，使间充质干细胞呈三维球体 状态生长，模拟细胞在体内的生长方式，不仅很好的保持其干性，而且减缓了 凋亡和衰老的进程，使间充质干细胞可以更好的应用于科研和临床。通过分析 树突状细胞分泌 IL-10 以及激活 T 细胞的结果，可以看出外泌体与细胞因子和细 胞接触一起参与了间充质干细胞对树突状细胞的调控，可能是通过其包含的蛋 白或核酸发挥了作用。间充质干细胞