基于活性探针分子对代谢型γ氨基丁酸受体激活机制的研究-生物物理学专业论文.docxVIP

A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy of Engineering The Research of the Activation mechanism of GABAB Receptor based on the active-based probes Candidate ： Lin Xin Major ： Biophysics Supervisor ： Prof. Liu Jianfeng Huazhong University of Science and Technology Wuhan 430074, P.R.China November, 2010 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保 密□ ，在 年解密后适用本授权书。 不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 I I 摘 要 G 蛋白偶联受体（GPCRs）在体内介导着多种配体引起的生理反应，如激素、神 经递质和感官刺激。我们设计并合成了针对 GABAB 受体的具有活性和光亲和力的分 子探针。以探针为基础，我们能够将 GABAB 受体锁定在非活性构象上，然后通过正 向变构剂来激活受体。从而能够对与 GABAB 受体激活相关的动态事件进行监测。我 们发现，GABAB 受体能够调控一个包含有 GABAB 受体、IGF-1R 及其下游效应物在 内的蛋白复合物发生一系列动态变化。其中值得注意的是，G 蛋白能够与静息状态 下的 GABAB 受体预偶联（pre-coupling），并在受体激活后迅速解离。我们还发现， 这种复合物的动态变化过程是 GABAB 受体激活的关键。我们的研究确定了一系列 GABAB 受体与下游型号蛋白间的相互作用，它们对于受体的激活非常关键。 GABAB1 亚基的胞外结构域（GABAB1-VFT）包含有配体结合位点（LBP），是一 个非常好的药物治疗靶点。为了对其结构开展进一步的研究，我们大量表达并纯化 了 GABAB1-VFT 重组蛋白。并且用配体亲和层析解决了重组蛋白的低活性问题，成 功地分离出了高活性的 GABAB1-VFT 蛋白。 同时，为了研究 GABAB 受体与配体的结合过程，我们设计了一个采用电喷雾质 谱、圆二色谱和荧光光谱等技术来监控蛋白质与配体结合过程中其二级结构和三级 结构变化的平台。在这个平台上，我们分析了了肌红蛋白在不同环境下与配体结合 和解离的过程。并发现由酸和有机溶剂引起的肌红蛋白的血红素解离现象具有不同 的内在机制。 关键词：GPCR GABABR VFT ABPP ESI-MS II II Abstract G protein-coupled receptors (GPCRs) mediate physiological responses to various ligands, such as hormones, neurotransmitters and sensory stimuli. We synthesized both active and affinity tagged photo-affinity probes specific to GABAB receptor. Such activity-based probes enabled us to first lock GABAB receptor in an inactive state and then stimulate the receptor with a positive allosteric modulator, thereby permitting monitoring of the dynamic events associated w