大鼠谷氨酰胺转运蛋白SNATEGFP融合蛋白的表达与鉴定.PDF

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(11): 1248– 1253 http ://www.cj 技术与方法 大鼠谷氨酰胺转运蛋白SNAT2-EGFP融合蛋白 的表达与鉴定 孟 雯 王 函　董晓云　李 洋　张 舟* ( , 200234) 上海师范大学生命与环境科学学院 上海 摘要 谷氨酰胺转运蛋白是中枢神经系统中一种重要的中性氨基酸转运蛋白, 对谷氨酰胺 的跨膜转运十分重要。为了更方便地研究大鼠谷氨酰胺转运蛋白2 (SNAT2)在细胞膜上的表达与 定位, 利用亚克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构建于SNAT2的C端, 通过菌液PCR 、酶切和 DNA测序鉴定重组真核表达质粒; 将测序正确的重组质粒瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T cells), 用Western blot和激光共聚焦电子显微镜荧光检测技术鉴定SNAT2-EGFP的表达与亚细胞定位。结 果表明, SNAT2-EGFP融合蛋白重组质粒在细胞中表达并正确定位于细胞膜上。SNAT2-EGFP融合 蛋白重组质粒的成功构建为今后深入研究SNAT2的结构和功能提供了一个有效的工具。 ; ; ; 关键词 谷氨酰胺转运蛋白 增强型绿色荧光蛋白 融合蛋白 表达 SNAT2 , 丙氨酸、谷氨酰胺等小的脂肪族类中性氨基酸 是一个内在膜蛋白 其分离纯化结晶过程既 , SNAT2 是人体重要的氮源来源, 其中谷氨酰胺是中枢神经系 复杂又有难度 目前还没有关于 晶体结构解 , 析的报道。 统中最重要的氨基酸之一 其直接参与了神经元中 — , , 谷氨酸 谷氨酰胺相互转变的过程 是刺激性神经 由于检测膜蛋白的有效抗体制备比较困难 现 [1-4] — 。因此这些氨基酸的跨 递质 谷氨酸合成的底物 在越来越多的科学家将膜蛋白与一些标签蛋白如绿 膜转运对物质代谢十分重要。谷氨酰胺等中性氨基 色荧光蛋白(GFP)、HA等构建在一起作为融合蛋白 酸的跨膜转运由谷氨酰胺转运蛋白(sodium-coupled , SNAT2 N 共同表达 取得了很好的效果。在 的 末端 neutral amino acid transporter, SNAT) , GFP , 2 负责 其功能紊乱 加上 蛋白 用以检测谷氨酰胺转运蛋白 的表达 , [17]; 1 (A