南开大学基因操作原理课件第三章[1].pptVIP

1.用于基因操作的工具酶总览 2.限制性核酸内切酶 1)寄主控制的限制与修饰; 2)限制酶与修饰酶; 3)限制酶的类型; 4)限制酶的命名; 5)限制酶的靶序列; 6)同裂酶. 1)寄主控制的限制与修饰 2)限制酶与修饰酶 (1)能够对外来DNA进行限制的酶称限制性核酸内切酶,简称内切酶。 (2)通过对外来DNA进行修饰,限制酶不再对其行使功能,起修饰作用的酶称修饰酶,修饰酶也称甲基化酶。 3)限制酶的类型 2）连接机制 2）Double Linker （1) 防止载体自连； （2）连接方向固定； （3）利用Double-Linker而不用homopolymer有利于将cDNA 片断置于promoter的控制之下。 3)DNA ligase 的性质 ——最适作用温度，370C 但在此条件下，粘末端之间氢键结合不稳定，故一般选择温度在酶作用速率和粘末端之间氢键结合速率之间，最适温度是160C 4.末端修饰 1）碱性磷酸酶 2）Double Linker 3）Adaptors 4）Homopolymer tailing 1)碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase) -------防止载体自连 * * 第三章 用于基因操作的工具酶 3.连接酶 1)DNA连接酶的作用机制; 2)DNA连接酶的性质与应用. 4.末端修饰 1)Double-linker; 2)Adaptors; 3)Homopolyer tailing. 1. Useful Enzymes for Molecular Cloning 2. Restriction Endonucleases (1) Plating Efficiencies of Phage Grown on E.coli Strains C,K and B When Plated on These Bacteria Strain Phage C K B lambda-C 1 10-4 10-4 lambda-K 1 1 10-4 lambda-B 1 10-4 1 (2) Note: ①.限制性核酸内切酶共分三型,用于基因操作的 是II型(目前从II型酶中分出一些酶,划归为IV型酶); ②.编码寄主控制的R-M系统的基因,有的存在于 染色体上,有的存在于质粒或原噬菌体上; ③.最早分离的限制酶是从E.coliK中分离的 (1968.Moselson,Yuan) Notes ①.产生平末端; ②.粘末端,5‘突出; ③.粘末端,3‘突出; ④.II型酶,它不在识别序列内切割,而在右侧切割,N指任意核苷酸（这些酶与II型酶尚有差别，分出来划归IV型酶）; ⑤.Pu指A or G,Py指C or T,凡符合条件的碱基配对均可切割; ⑥.在一些条件下(低离子强度,碱性pH,50%以上的甘油浓度),EcoRI的特异性降低,只要符合中间四个碱基即可, 称EcoRI星活性(EcoRI*)。许多其他的酶也有这种性质。 ⑦. EcoRI II未按规则,I II指两个酶分别位于两个抗性转移因子(质粒) RI RII上 4)Nomenclature(Smith Nathans) (1).三字母组成(斜体) Escherichia coli Eco(埃希氏菌属,大肠杆菌) Haemophilus influenzae Hin(嗜血流感杆菌属,嗜血流感杆菌) (2).代表株或型的字母 EcoK E.coliK 菌株(EcoR限制修饰系统位于质粒RY13上) (3).同一宿主同时有几个不同的R-M系统,用罗马数字表示 HindI II III嗜血流感杆菌Rd菌株的三个R-M系统. (4).同时提到限制酶与修饰酶时,加R,M区分RHindIII(限制酶) M HindIII(甲基化酶) 【EcoRI II未按规则,I II指两个酶分别位于两个抗性转移因子(质粒)上】 5) .Target Site(靶序列） （1）结构:II型限制酶靶序列均为回文结构，可以是4，5，6，7个核苷酸； EcoRI 5‘-G A A T T C-3’