空间分辨荧光分析技术-中国显微图像网.PDF

( ) 第 32 卷 分析化学 FENXI HUAXU E 　研究报告 第 11 期 2004 年 11 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1421～1425 空间分辨荧光分析技术 李耀群 　姚闽娜 (厦门大学化学化工学院现代分析科学教育部重点实验室 , 厦门 361005) 摘 　要 　空间分辨荧光分析技术突破了传统荧光分析的局限 ,为获得空间定位信息提供了技术保障。系统地 综述了构成该技术的共焦荧光法、全内反射荧光法、多光子荧光法以及近场荧光法等 4 种方法的原理、特点、 发展及其应用 ,并且强调了其在单分子测定中的作用。引用文献 64 篇。 关键词 　空间分辨荧光 ,共焦荧光 ,多光子荧光 ,全内反射荧光 ,近场荧光 ,单分子 ,评述 1 　引　　言 现代分析化学正向着信息多维化的方向发展 ,空间分辨的重要性日益受到重视。荧光分析技术灵 敏度高 ,选择性好 ,可提供有关分子结构、环境影响因素等诸多信息。然而 ,传统荧光分析技术缺乏空间 ( ) 分辨能力 将空间上某一位点信息定位抽取出来的能力 。随着现代仪器手段的发展 , 具有空间分辨能 力的荧光分析技术已成为现实 , 并且随着应用领域的不断扩大 ,正逐渐形成一个新的研究分支 ———空 间分辨荧光分析技术。该项技术主要包括: 共焦荧光法、多光子荧光法、全内反射荧光法以及近场荧 光法。这些技术虽然原理各异 ,但都具有独特的空间分辨能力。共焦荧光法利用“针孔”效应 , 可对样 品进行纵深剖析。多光子激发荧光法根据非线性光学原理提高了空间分辨率。全内反射荧光法则可有 效排除本体干扰 ,获取界面层信息。近场荧光法则借用扫描隧道显微镜原理 ,得以突破传统光学衍射的 限制。这些具有空间分辨能力的方法的出现和发展 ,直接导致了单分子水平测定的实现 ,并在材料科 学、生物科学和医学等领域展示出巨大的作用。 2 　共焦荧光法 2 . 1 　基本原理与特点 共焦荧光法采用光学系统的共轭焦点( ) 共焦 技术 ,使光源、被照物点和探测器处于彼此对应的共轭 ( ) 位置。共焦荧光显微镜与普通光学显微镜最大的区别在于其光路中设置了两个聚焦针孔 光孔 ,针孔 起了一个空间滤波器的作用 ,把来自样品的各种杂散光阻挡在外 ,从而保证检测信号是来自样品某特定 位点。激光光源发出的激光束 ,通过第一个针孔聚焦在样品的某一层面上 ,激发其荧光团 ,发射出的荧 光经聚焦穿过第二个针孔到达检测器 ,而焦平面以外的荧光被聚焦在第二个针孔之外 ,不能穿过第二个 针孔 ,也就不能传输到检测器中。因此 ,检测器只能检测到焦平面所发出的荧光信号 ,沿样品垂直方向 移动样品或物镜的位置 ,就可获得样品不同深度层面的信息 ,而无需破坏样品 ,这就是共焦荧光测定的 基本原理。在成像的过程中 ,重要的是需使两个焦点严格地位于共焦显微镜的光轴上 ,这个光轴一般称 为 Z 轴。在共焦荧光系统中 ,须选择适当大小的光孔孔径 ,才可保证足够高的分辨力和足够强的光信 号。利用共焦荧光法 ,可有效地减少非探测区散射光及无用荧光信号的影响 ,提高分析灵敏度和对样品 的空间定位能力。共焦成像的分辨是普通显微镜的 2 倍 , 即介于普通光学显微镜和电子显微镜之间。 共焦显微镜还具有 Z 向观察能力,其深度分辨力是普通显微镜的 2 倍 ,可达 0. 1 μ m 。而且突破了普通 显微镜只能观察平面图像的限制 ,用“光学切片”代替机械切片 , 实现了逐层剖析。构成的三维图像具 有对比度高、成像清晰和信息量大等优点[1 ,2 ]