第四节 基因差异表达获得目的基因.pptVIP

　　在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因，按时间、空间进行有序的表达方式，称为基因的差异表达。 　　真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达，产生出大约15 000种不同的mRNA分子。　　 DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术 第四节 基因差异表达获得目的基因 差异显示PCR（DDRT-PCR） （1）3’ 锚定引物 Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT M：A、G or C N: A、G、T or C 5’ 3’ 利用mRNA的poly A尾巴设计 利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增 12种锚定引物 AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTTTTTT 5’ 3’ 　这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示。 　　使用这种锚定引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。 （2）5’端的随机引物 同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5’端又设计了20种10bp长的随机引物。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT 5’ 3’ RT NM TTTTTTTT 5’ cDNA 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ cDNA第二链，并PCR （3）用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增 12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。 引物组合： 实验结果： 如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。 在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。 240组能分出20000多条带！ （4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较 相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳 选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。 再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。 优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等； 缺点：假阳性率高、获得的cDNA片段很短。 1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。 一、化学合成目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法、 自动化合成法。 第五节 基因的化学合成 1、互补延伸连接法 二、化学合成DNA片断的组装 　预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。 3’ 5’ 5’ 3’ Klenow片段 引物 5’ 3’ T4DNA连接酶 T4多核苷酸激酶 （3）T4 DNA连接酶连接 T4多核苷酸激酶 完整的DNA双链 2、互补连接法 （合成的DNA单链的5’端是-OH） （2）5’端磷酸化 （1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 1.全基因化学合成 2. 合成引物（20mer左右） （1）mRNA的含量很低，很难操作cDNA 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断。 （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 三、 化学合成的应用 DNA合成仪 5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点的人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。 EcoRI EcoRI Linker Adaptor 本章重点掌握的内容 目的基因的概念 基因文库的概念及构建基因文库的基本程序 基因组文库的概念及操作步骤 cDNA文库的概念及操作步骤 基因组DNA文库与cDNA文库的优缺点与异同点 目的基因的分离方法及主要特点 同时为扩增出polyA上游500bp以内