猪链球菌2型检验程序-中国疾病预防控制中心.PDF

猪链球菌 2 型检验程序 病人检样（脑脊液，关节液，血液） 增菌培养 （脑心肉汤） 革兰氏染色 （有G+成对球菌、短链球菌） 羊血琼脂平板 （37℃，5%CO2 ，24h ） α溶血 β溶血 γ溶血 PCR 检测 血清学检测 生化鉴定 一、 分离步骤和程序 1．可采集病人的血，腹水，脑脊液或者是尸检标本；病、死猪的肝脏、 脾脏、腹水、心血。4 ℃保存。 2 ．制作肝脏、脾脏的触片，或用腹水、血液、脑脊液涂片，火焰固定后 进行革兰氏染色，油镜下观是否有成对或短链状革兰氏阳性球菌。 3 ．取有成对或短链状革兰氏阳性球菌的标本接种选择增菌培养液（含 15 微克/毫升多粘菌素 B ，30 微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基），或 直接划线接种含两种抗生素的羊血琼脂平板培养基，在蜡烛缸或 CO2 培养箱中培养。 二、 血清学检测 1．用兰氏分型乳胶凝集链球菌试剂盒进行分群 2 ．用猪链球菌 1-34 个型血清进行分型 取一滴猪链球菌诊断血清悬滴于载玻片上，与一滴菌悬液充分混合，或 用接种环（牙签也可）刮取单个菌落直接与血清混合，观察是否出现凝 集反应，同时用生理盐水做对照。 三、 生化反应 可用 API 生化鉴定系统的 api-strep 手工鉴定条进行鉴定，该方法可 直接鉴定到种。普通实验室可以重点做 VP ,七叶苷水解试验，6.5%的氯化 钠生长试验，45 度﹑10 度生长试验，胆汁耐受（麦康凯培养基）。结果依 次为阴性，阳性，阴性，阴性，阴性，阴性，可初步认为猪链球菌。可送 交到有条件的单位做进一步鉴定。 具有参考价值的生化反应项目有： 3.1 生长特性 麦康凯培养基 10℃ 45 ℃ 6.5%NaCl PH9.6 （胆汁耐受） 不生长 不生长 不生长 不生长 不生长 3.2 发酵试验 棉子糖 乳糖 甘露糖 山梨醇 阿拉伯糖 核糖 RAF LAC MNS SOR ARA RBS + + — — — — 葡糖 甘露醇 丙酮酸 甘油 松三糖 马尿酸盐 INU MAN PRV Glycerol melezitose hippurate + — — — — — 四、 基因鉴定， 包括使用 PCR 技术和对 PCR 产物进行序列 分析 可挑取分纯的菌落或在选择平板上湿润的可疑菌落，直接进行 PCR 检测。 1 、 检测猪链球菌种特异性 16S rRNA。 上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa 2 、检测猪