牛睾丸组织b-Boule基因表达的甲基化调控分析.pdfVIP

中文摘要 牛睾丸组织b-Boule基因表达的甲基化调控研究 摘要 Boule基因是DAz基因家族成员之一，在哺乳动物精子发生过程中发挥重要 的调控作用，Boule基因敲除的小鼠精子发生障碍并最终导致雄性不育．实验室 发现b-Boule基因在睾丸组织中特异表达，且黄牛、牦牛睾丸组织申的表达水平 显著高于种问杂种(犏牛)。目前关于DAZ家族基因在精子发生过程中的表观遗 传学调控的研究主要集中在DAZL基因上，而关于Boule基因表达调控方面的研 究还未见报道．为了进一步研究犏牛睾丸组织中b-Boule基因低表达的调控机 制，本文拟采用克隆测序技术获得黄牛乖犏牛睾丸组织中b-Boule基因启动子区 序列和基因内CpG岛序列，采用亚硫酸氢盐测序技术检测黄牛和犏牛睾丸组织中 b-Boule基因启动子区乖基因内CpG岛甲基化水平的差异；构建启动子区缺失表 达载体，采用荧光素酶双报告基因系统检测b-Boule基因核心启动子区的位置； 体外甲基化试验验证启动子区甲基化对b-Boule基因表达的影响，以期从表观．遗 传学角度分析犏牛睾九组织中b-Boule基因低表达的分子机制，为阐明犏牛雄性 不育的机制提供理论依据． 1．b-Boule基因的基因组序列分析 根据实验室前期获得的b-Boule基因eDNA序列，在牛基因组数据库中进行 侧翼序列和4kb的3’侧翼序列)．电子染色体定位发现b-Boule基因定位于2 号染色体，与人BOULE和小鼠Boule基因在染色体间存在高度的保守同缉巨．基 因组结构分析发现b-Boule含有11个外显子和10个内舍子。通过生物信息学软 件预测发现在b-Boule基因5’端存在四个潜在转录起始位点，分别位于-236bp、 基因存在2个典型的Cp6岛：一个位于5’端，长度为2229bp，贯穿于5’非编 码区、第1外显子舜口第1内含子，另一个位于基因内部第5和第6外显子之间， 长度为992bp． 2．b-Boule基因5’调控序列的克隆与启动子活性分析 动子序列，同源分析发现，黄牛和犏牛b-Boule基因启动子区核苷酸序列一致 100％。首先，构建了4个双荧光素酶缺失表达载体，瞬时转染293细胞，结果发 牛睾丸组织b-Boule基因表达的甲基化调控研究 1 录因子结合位点，其中Spl为甲基化敏感位点。 3．黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因CpG岛甲基化分析 采用亚硫酸氢盐测序技术对黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因核心启动子 区DNA甲基化状态进行了分析，结果发现在b-Boule基因核心启动子区含有9 CpG位点的甲基化水平差异更明显(黄牛为13．67％，犏牛为83．33S)，结合实验 室前期睾丸组织mRNA表达水平和组织学观察结果，推测启动子甲基化在b-Boule 基因的表达调控中发挥关捌tct用，犏牛b-Boule基因核心启动子区的高甲基化可 能与犏牛精子发生障碍．雄性不育有关．黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因内 CpG岛甲基化状况分析结果显示：表明黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因内CpG 岛DNA甲基化水平差异结果差异不显著(P0．05)． 4．b-Boule基因启动子区体外甲基化分析 的影响，构建了包括核心启动子区在内的表达载体，采用CpG甲基转移酶(M． SssI)进行体外甲基化修饰，瞬时转染293细胞，结果发现甲基化修饰后，载体 了b-Boule基因的表达． 关键词：牛；b-Boule基因；启动子活性分析；体外甲基化；CpG岛 II 英文摘要 TISSUE oFBoVINETESTICULAR STUDY GENE REGULATIoNoF M[ETHYLATIoN B—BOULE EXPRESSIONOF