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* 植物组织培养的应用： 第四章 人工种子与植物脱毒 ? 1. 人工种子（Artificial seed）定义：是指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳(Artificial endosperm)和人工种皮(Artificial seed coat)中形成的类似种子 的颗粒。又称合成种子(Synthetic seed)或体细胞种子(Somatic seed)。 体细胞胚再生途径的应用： §4.1 人工种子 ? 在结构上从外向里包括三部分：（1）人工种皮外层，保护胚状体 中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；（2）人工胚乳，含有 必需的营养成分和某些植物激素；（3）胚状体或芽。 2.人工种子的优点 ? （1）便于运输和储藏（相对于试管苗）。 ? （2）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通 过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分 ，使人工种子优越于天然种子。 ? ? （3）可以固定杂种优势，保存珍贵稀有植物品种。 （4）利于快速繁殖，生产效率高（尤其是没有种子和种子昂贵的植物）。 3. 人工种子制作 ? （1）胚状体同步发育 ? ? ? ? ? 控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的关键环节之一，主要方法如下： 抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如5-氨基尿嘧啶），去除抑制剂后细胞可以同步发育(S期始）。 低温法：低温处理使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，使分裂指数提高，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化(G1期始）。 渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。 通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培养基中通入3-5%乙烯+CO2或氮气控制细胞同步分裂。 分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。 （2）人工种皮制作 ? 理想的人工种皮(Artifical seed coat)应该具有保护 胚状体的功能，并且具有无毒、良好的通气性、抗 污染、适合运输等特点。 ? 最早采用的材料是聚氧乙烯，但是具有一定毒性、 易溶解于水等不足。目前采用海藻酸盐（钠、钙）较多，其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，例如：水性营养成分易流失、表面易结团等。因此，开发理 想的人工种皮材料仍是一个重要课题。 （3）人工胚乳配制 ? 人工胚乳(Artifical endosperm)主要包括无机盐 、碳水化合物、蛋白质等（如MS培养基成分），为胚 胎发育提供营养保证。 ? 由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以还 要加入防腐剂、抗菌素、农药等成分。 藻酸钠等水溶性凝胶与Ca2+进行离子交换后凝固 （4） 包埋 ? 方法主要有以下两种： ? 干燥法：这是比较早的一种包埋方法。将胚状体 置于23℃、70%左右相对湿度、黑暗条件下逐渐 干燥，然后用聚氧乙烯等种皮材料包裹。 ? 水凝胶法：这是目前比较常用的一种方法。用海 的特点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓 度与络合时间控制。 海藻酸钠包埋示意图 包埋液（人工胚乳）制备： 2%-4%的海藻酸钠+营养 物、生长因子等如MS。 将成熟的体细胞胚胎与包 被液相混合，然后将其滴 入（只允许一个通过）适 当浓度的氯化钙溶液中， 经过络合作用（生成海藻 酸钙）的造形过程，在20- 30分钟内形成内含细胞胚、 有一定硬度的雏形人工种 子。 （5）人工种子的储存 一般将人工种子贮藏在4—7℃低温、相对湿度小 于67%的条件下。实际上随贮藏时间的延长,人工 种子的萌发率会显著下降。 4. 人工种子制作存在的问题 ? （1）人工种皮性能不尽人意。 ? （2）还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工胚乳。 （3）胚状体储藏阶段的休眠控制； （4）如何保证长期储藏而又不影响萌发率； （5）制作流程较繁琐、成本高。 （6）许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚。 §4.2 植物脱毒 ◆ 植物脱毒 ● 为什么？（植物病毒及其危害） ● 怎么脱毒（方法）？ ● 如何鉴定？ 1、植物病毒及其危害 烟草花叶病毒TMV 当病毒侵染寄主植物后，感病植物代谢异常， 使植物的叶片黄化，褪绿，皱缩，卷曲； 使植株矮化，坏死； 使果实减少或畸形。 植物病毒的危害 2、植物脱毒方法 方法： 物理方法：高温、低温处理法，X射