课件：血管内皮祖细胞(EPC)与自体骨髓干细胞移植.ppt

拟胚体形成 悬浮培养法： 以0.25%的胰酶/EDTA消化接近完全融合的鼠ESC，离心去上清，重悬计数。将细胞悬液按不同的密度接种至低粘附的培养皿中，采用不同的培养基培养，观察细胞形成悬浮的球形细胞团，即拟胚体（embryoid body，EB）的数量及生长状态。 拟胚体形成：悬浮培养法 Day2 Day9 Day4 Day12 ×200 ESC的分化诱导——简单两步法 第一步：EB形成： 采用悬浮培养法 第二步：EB的直接种植培养： 取培养第4天的EB悬液，按50-100μl/孔用量移入0.1%明胶预衬的6孔培养板中，以分化培养基培养，每1-2天换液一次，换液时以PBS或Hanks液洗去未贴壁细胞。待细胞至70%-80%融合时，进行消化传代，即为ESC-EC P1。一般5-7天传代一次，多余细胞冻存。 拟胚体的分化种植 将Day4的EB直接种植，采用分化培养基培养，6小时内即贴壁生长，24h后可见从贴壁生长的EB周围出芽样长出梭形或多角形细胞，向外放射状生长，并与周围集落融合。 EB Day4，×400 Day1，×200 Day2，×100 Day4，×100 Day9，×100 Day15，×100 分化细胞的鉴定 DiI-Ac-LDL摄取实验：P9 P9，×400 分化细胞的鉴定 DiI-Ac-LDL摄取实验：L929（阴性对照） ×400 分化细胞的鉴定 荧光双染： DiI-Ac-LDL摄取及FITC-UEA-1 P1，×400 分化细胞的鉴定 免疫组化染色：CD31 空白对照，×400 P15，×400 分化细胞的鉴定 免疫组化染色：Flk-1 空白对照，×400 P15，×400 分化细胞的鉴定 流式细胞仪检测： CD31阳性细胞比例逐渐增加，第2代（P2）时即可达71.7%~82.4%（平均76.6%），P6时则达84.8%~90.1%（平均86.1%），不断传代后最终维持在90%左右的较高水平。 P2 P6 P9 分化细胞的鉴定 透射电镜检测： 分化产生的细胞胞质内细胞器丰富，核周有散在的粗面内质网和丰富的糖原颗粒，线粒体甚为丰富。 分化细胞的鉴定 透射电镜： 细胞膜下及胞质内常见大小不等的吞饮小泡及多泡小体。 分化细胞的鉴定 透射电镜： Weibel-Palade（W-P）小体，是位于胞浆内的棒状呈束的微管，周围有单层膜包被。 结论（2） 采用简单的贴壁培养，单独采用VEGF即可成功诱导小鼠胚胎干细胞分化产生内皮样细胞。 经传代培养后，分化细胞中CD31阳性细胞可达到90%以上，纯度高。 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 血管新生（neovascularization）有三种方式：血管生成（angiogenesis）、血管发生（vasculagenesis）和动脉生成（arteriogenesis） 血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管；血管发生是指在原来没有血管系统的情况下，通过EPCs和造血干细胞产生血流的新通道 传统观念认为vasculagenesis仅和angiogenesis共存于胚胎发育时期，而不参与出生后的血管新生。正是1997年Asahara等首先报道了“出生后血管发生（postnatal vasculagenesis）”，才使这一观念得以纠正 目前认为：vasculagenesis和angiogenesis不仅共存于胚胎发育时期，而且还参与出生后的血管新生 图 2 血管生成和血管发生 EPC参与出生后诸多的生理过程 补充血管壁脱落的EC 女性子宫和卵巢的周期性变化都有血管发生的参与 转基因小鼠的系统研究证明 ，在脑、肺、肝、肠、皮肤及肌肉的血管中都整合有一定的转化细胞，在排卵期的黄体和子宫内膜上尤为明显 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 EPC参与了出生后诸多的病理过程 肢体缺血 心肌梗塞 肥胖相关疾病：Ⅱ型糖尿病、高血压、高血脂 糖尿病视网膜病变 肿瘤 动脉粥样硬化 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 治疗性血管发生（therapeutic vasculogenesis） 1999年，Isner等首先提出了“治疗性血管发生”的概念 倡导以提高补充EPC数量来增加血管生长因子的作用底物，达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病 这一疗法充分利用成年机体血液循环中存在EPC、EPC对缺血组织的自动趋化能力和归巢能力、EPC能分化形成血管的生物学特性，可以说是一个生理加强疗法。 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 治疗性血管发生 治疗肢体缺血（图3） EPC功能分类 Early EPC:来源于CD14+细胞 Late EPC:来源于CD14-细胞 Mukai N，et al.Experimental cell re