2016现代组织化学技术-组织化学.pptxVIP

现代组织化学技术组织化学与细胞化学学习要求1．掌握组织化学技术的基本概念2．熟悉组织化学和免疫组织化学标本的制备方法及过程3．掌握酶组织化学的基本原理4．熟悉高碘酸Schiff（PAS）反应、过氧化物酶、酸性磷酸酶铅法的基本原理一、绪论1. 什么是组织化学与细胞化学技术？Histochemistry and cytochemistry------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化学”------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应，采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律一、绪论H-E染色H-E染色2. 组织化学与细胞化学技术的特点普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察一、绪论2. 组织化学与细胞化学技术的特点组织化学与细胞化学技术PAS法显示粘多糖铅法（ATP酶）组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察——对组织或者细胞内特定物质进行定性，定位， 定量分析 一、绪论3. 组织化学与细胞化学技术的主要类型化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方法，免疫学方法，分子生物学方法等常用分类：(1) 一般组织化学与细胞化学(2) 免疫组织化学与细胞化学(3) 原位杂交组织化学* 每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分一、绪论4. 组织化学与细胞化学技术的基本要求 保持组织和细胞的完整性 被检物质具有不溶性和（或）可视性 反应具有特异性 反应具有灵敏性 可重复性二、标本的制备1. 取材（draw material）(1) 组织标本取材：准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、大小适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）(2) 细胞标本取材：涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度低时可先沉淀或者离心；爬片法：贴壁生长的培养细胞；印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞二、标本的制备2. 固定（fixation）(1) 固定的目的：保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性非常重要(2) 固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损二、标本的制备2. 固定(3) 常用固定剂的种类及特点单一固定剂：交联固定剂甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间（8?24小时），降低固定温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通过抗原修复等可提高抗原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%多聚甲醛（应用最为广泛）、2.5%戊二醛等戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有影响二、标本的制备2. 固定(3) 常用固定剂的种类及特点单一固定剂：凝固沉淀固定剂丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结构会破坏，因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 为宜。其他固定剂铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微细结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂二、标本的制备2. 固定(3) 常用固定剂的种类及特点混合固定剂：Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固定均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常用Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的保存优于Bouin固定液二、标本的制备2. 固定(4) 固定的方法浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸渍法和灌注法用的最多浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好标记，直接将组织块修整为合