医学免疫学荧光免疫技术.pptVIP

荧光免疫技术 基本概念 抗原抗体反应具有高度特异性 荧光物质的检测具有灵敏性和直观性 荧光免疫技术是将两者有机的结合起来 将荧光物质与抗原（抗体）连接，形成荧光标记物 再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测 按技术原理及用途分为 荧光抗体染色技术 　　　用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测 荧光免疫测定 　对体液标本中的抗原或抗体进行定量检测，有均相和非均相两种 荧光抗体染色技术 基本原理 在基质片上，通过抗原抗体的反应，连接上荧光素标记的的抗体，借助荧光显微镜观察有无荧光及部位，最终作出定性、定位的判定 技术要求 基质片 荧光抗体 荧光显微镜 基质片 将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原 根据标本来源不同可分为 组织印片、组织切片、细胞涂片、细菌涂片 制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存 荧光抗体 用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成 荧光的基本知识 自然界某些物质能从外界吸收能量（光能、化学能），外层电子发生跃迁，进入激发态，从激发态回复至基态时，多余的能量以光能的形式释放，产生荧光，可分为光致荧光、化学荧光、X线荧光 荧光物质不会将全部吸收的能量都转变为荧光，在此过程中，吸收能量转变为荧光的百分率称为荧光效率。 荧光物质发射荧光的能力减弱甚至不能发射荧光称为荧光的淬灭 使荧光发生淬灭的因素有：长时间激发光照射、某些化学物质（苯胺、酚、硝基苯、卤化物等） 环境因素对荧光物质产生荧光强度有影响（pH、温度、荧光素的浓度、基质片上的固定剂等） 荧光抗体 作为标记的荧光物质应具备的条件 与蛋白质分子能稳定结合， 标记容易，结合后不影响蛋白质活性 荧光效率高 荧光色泽与背景色泽对比鲜明 物质易得，来源广泛 荧光抗体 荧光抗体染色技术中常用的标记荧光物质 最大吸收波长 最大发射波长 异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 藻红蛋白 495nm 570nm 550nm 490～560nm 525nm，黄绿色 595nm，红色 595nm，红色 620nm，橙红色 在其他荧光免疫技术中的荧光物质：镧系金属、酶作用产生荧光的物质（MUG） 荧光抗体 制备 FITC中含活性基团（－N＝C＝S）在碱性条件下能与蛋白质中赖氨酸的NH2发生反应，使两者共价结合 在碱性条件下（CB），将待标记蛋白质与FITC按一定比例混合，反应一段时间 生成物经分离纯化、鉴定合格后小瓶分装，低温下保存 需去除的有游离的FITC、过度标记的蛋白质、标记的非特异性抗体 按公式计算F/P的值，一般固定标本1.5、活细胞染色2.4为宜 荧光显微镜 用于观察荧光的特殊装置 除与普通的显微镜一样能观察细胞、亚细胞结构外，还应有 光源　作为激发光，引起荧光的发出 滤光片　隔热滤光片、激发滤光片、吸收滤光片 聚光器 观察到的荧光包括 特异性荧光 由抗原抗体反应后，荧光抗体结合在基质片上，所发出的荧光 非特异性荧光 背景荧光 洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附 交叉反应 荧光抗体染色法 技术类型 直接法 间接法 补体结合法 双标记法 直接法 原理 待测标本 荧光抗体 荧光 方法简单、快速、特异，灵敏度低，每检测一种抗原，需制备相应的荧光抗体。常用于细胞、病毒的快速检测、肾活检和皮肤活检 间接法 原理 已知抗原 待测抗体 荧光素标记的抗抗体 荧光 方法灵敏、检测过程中只需制备一种荧光素标记的抗体。常用于自身抗体的检测 标记的抗体为针对所检测物种所分泌的免疫球蛋白 补体结合法 原理 已知抗原 待测抗体 抗补体 荧光 方法灵敏、荧光抗体也只需一种，但操作繁琐、影响因素多，不常用 荧光素标记的抗体为抗补体的抗体 双标记法 原理 用两种不同的荧光素分别标记两种特异性抗体，再与基质片作用后，用荧光显微镜观察，以荧光的颜色来判断相应抗原存在的情况 时间分辨荧光免疫测定 基本概念 荧光免疫技术对物质进行检测时，待测物质的含量与生成物荧光的强度存在着量的关系 在激发光照射后一段时间，除特异性荧光外，反应体系中还可能存在着其他非特异性荧光，以这段时间内的荧光强度代表反应体系的荧光强度，会导致结果的偏差 激发光照射后经过一段时间，待非特异性荧光消失，而特异性荧光仍然存在，这时再测量反应体系的荧光强度 标记物应用荧光寿命比非特异性荧光寿命长的荧光素 时间分辨荧光免疫测定 标记物 三价镧系(Eu、Sm、Tb、Nd、Dy)金属离子螯合物 荧光特点 荧光寿命长（比非特异性荧光寿命长5～6个数量级） 激发光（340nm）与发射光（613nm）相差大，易分开 激发光谱宽（增加激发能）、发射光谱窄（降低本底荧光） 荧光标记相对比活性高 时间分辨荧光免疫