荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述.pptVIP

ABI比较 Bio-rad test * Bio-rad melting curve * 选择BioTeke，选择信任与回馈 Fax：010 Tel：010 E-mail: info@ MSN:grasepp@ QQ:感谢聆听！ THANK YOU FOR WATCHING! 演示结束！ * * * * 所谓实时荧光定量PCR,就是实时监测PCR过程中每一个循环的产物的荧光信号，得到一个荧光变化曲线，以此来实现对初始模板的定量分析。对于这个定义，大家可能会问两个问题，第一个就是在PCR过程中这个荧光信号是怎样产生的；第二个就是得到荧光曲线后如何实现对初始模板的定量。关于第一个问题，我留在后面讲，但大家要记住一点，这个荧光信号与产物量是成正比的。 我先解释第二个问题。 * Real-time qPCR数据分析 基线（baseline） 通常是3－15个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold) 自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值， 但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct值 :与起始浓度的对数成线性关系 分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。 统计分析方法 绝对定量： 此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。 ? 相对定量： 通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,一般是 2-??Ct 。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。 绝对定量 相对定量 Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005 相对定量 实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 敏感性高 需要样品少 特异性高（Taqman） 精确定量 Real-time qRT-PCR优点 RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 特异性 重复性 灵敏度 其他问题 常见问题讨论 扩增的特异性 引物？ Tm，重新设计引物，优化条件 Tm 重复性判断实验优劣的重要指标 判断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV） 影响重复性的因素： PCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 。 目的基因的初始浓度： 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。 标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA。 影响灵敏度的因素 反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶 要尽可能地优化引物设计 如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。 注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。 循环数 Mg2＋的浓度 Q1:无Ct值（信号）出现 可能性不大 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Q2:Ct值出现过晚（Ct＞38） 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 Q3:标准曲线的线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。 Q4:阴性对照也出现明显的起飞 反应mix或水被污染。 引物二聚体的出现： 用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合