生化chapter+03-07+amino+acids+and+pr化oteins-4.pptVIP

常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 分级沉淀（盐或有机溶剂） 4.3 根据蛋白质溶解度大小建立的分离纯化方法 工艺流程说明： 1.发酵液预处理 2.压滤 3.浓缩 4.沉淀 5.压滤 6.干燥 4.4 根据蛋白质电荷差异建立的分离纯化方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 平板电泳 等电聚焦电泳 4.5 根据蛋白质吸附特性建立的分离纯化方法 4.6 根据蛋白质特异亲和 力建立的分离纯化方法 凯氏定氮法 紫外吸收法 双缩脲法 Folin-酚法（Lowry法，蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产生蓝色。 ） Bradford法（考马斯亮蓝染料结合法） BCA法（bisinchoninic acid method） 4.7 蛋白质含量测定的常用方法 4.7.1．凯氏定氮法 原理：氮在蛋白质分子中含量恒定（平均占16%），因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。 每克样品中含氮的克数×6.25×100=100克样品中蛋白质的含量（克%）。 将蛋白质样品用浓H2SO4 消化分解（加热、常加少量的硫酸铜、硫酸钾作催化剂），使其中的氮转变为铵盐，碳转变为CO2，硫转变为SO2、SO3等逸出。铵盐再与浓碱反应，放出的氨被酸（硼酸）吸收，滴定剩余的酸，算出氮的含量。 4.7.2 紫外-分光光度计法 由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，但各种蛋白质中的这两种氨基酸含量差别不大，所以在280nm吸收值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定 此法准确度较差，因为有诸多因素的干扰（如核酸），通常用280nm及260nm下的吸收差大概计算蛋白质的浓度 蛋白质浓度mg/ml=1.45A280－0.74 A260 由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来使用 。 4.7.3 双缩脲法（Biuret法） 包含肽键基团的化合物能与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物。 在540 nm处测定其吸光值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。 双缩脲法的测定范围为1~10 mg蛋白质。 优点是快速，缺点是灵敏度差。 4.7.4 Folin-酚试剂法（Lowry法） 其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反应，然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在650~660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。 此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质测量范围在25~250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受还原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。 4.7.5 考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） 用考马思亮兰G-250染色蛋白质，出现的颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在595nm的光波下，有强烈吸收峰。 常用此反应来定量测定蛋白质含量。 4.7.6．BCA法 BCA法是对一价铜离子敏感、稳定和高特异性活性的试剂。 在碱性溶液中，蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，一价铜离子与测定试剂中的BCA形成一个在562 nm处具有最大光吸收的紫色复合物，该复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。 电泳 （等电聚焦、SDS、PAGE） 沉降法 HPLC 溶解度分析 N－末端分析 4.8 蛋白质纯度测定的常用方法 5.1 蛋白质组学的基本概念 蛋白质组学是研究与基因组相对应的蛋白质组的学科。 它与蛋白质化学截然不同。蛋白质组学将组织或者细胞中的蛋白质作为一个系统来研究，而蛋白质化学则只研究蛋白质的单一组分。 蛋白质组学的内容是系统生物学，重点研究作为一个大系统或部分网络的组成的多个蛋白质的相互作用。 蛋白质组学的研究目标可分为两个层次。一个层次是研究产生特定蛋白质的原因，以找到应对的策略，人为地控制蛋白质的表达，称为表达蛋白质组；另一层次是阐明已得到蛋白质的功能，称为功能蛋白质组 。 双向电泳技术、计算机图像分析、大规模数据处理技术、质谱技术被称为蛋白质研究的四大支撑技术。 蛋白质组学研究基本过程是：从细胞、体液或组织中提取蛋白质，经双向电泳技术分离得到蛋白质的表达图谱；采用计算机图像分析技术对图谱上的蛋白质点进行定位、定量、图谱比较、差异点寻找；然后采取两种方法进行蛋白质的鉴定，一是采用蛋白质转膜法进行氨基酸组成和序列分析，再进行数据库搜索比较；二是利用质谱技术进行蛋白质鉴定；最后需要利用生物学或者生物化学方法进行功能的研究和验证。 5.2 蛋白质组学的研究方法 蛋白质组学研究的技术路线 5.2 蛋白质组学的研究方法