第五章目的基因的制备1.ppt

第五章 目的基因的制备 经典原核克隆体系流程图 目的基因的获取 1 基因组DNA片断化 2 PCR技术扩增目的基因 3 化学合成基因 4 基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建 cDNA文库的构建 1 基因组DNA片断化1.1 限制性内切核酸酶酶切法 该法适于从简单基因组中分离目的基因，如质粒和病毒等DNA 。 特点： 优点：由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。 缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！ 1.2 机械切割法 1）超声波 　超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。 2）高速搅拌 　1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。 目的基因的获取 1 基因组DNA片断化 2 PCR技术扩增目的基因 3 化学合成基因 4 基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建 cDNA文库的构建 PCR ，Polymerase Chain Reaction （1）反应体系： 含有目的基因或序列的DNA模板 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg 2+等 如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可以合成一对与模板DNA 互补的引物，利用PCR技术扩增出含目的基因的DNA 片段。 局限性： 必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。 常规PCR 扩增片段一般在lkb 以内。 未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型的PCR ： 套式PCR、反向PCR、不对称PCR、 多重PCR、锚定PCR、长程PCR、反转录PCR、荧光定量PCR 和原位PCR等。 1）Nested pcr （套式PCR） 特点: 需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模版 套式PCR 通过内外引物进行两次扩增，大大提高了检测的敏感性 2） 反向PCR（Inverse PCR） 基本原理： 扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成DNA。 6）原位PCR 将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上； 加热变性，加引物、dNTP、TaqDNA聚合酶到载玻片上 在原位 PCR仪内进行PCR扩增、检测。 可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可精确定位 7）定量PCR： 荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 目的基因的获取 1 基因组DNA片断化 2 PCR技术扩增目的基因 3 化学合成基因 4 基因文库技术获取目的基因 基因组文库的构建 cDNA文库的构建 3.1 DNA合成仪的基本工作原理是： 将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸固定于不溶性载体上． 该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应，形成二核苷酸分子 通过酸或碱洗脱其一端的保护基团，再次与另一个5 ’或3’保护的核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成三核苷酸分子； 再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。 接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上洗脱下来。 3.2 DNA片断的组装 化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 3.2.1 互补连接法 1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH） 3.2.2 互补延伸连接法 预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。 化学合成法优缺点 优点：准确性极高，合成速度较快 缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80个碱基) 一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头或衔接物序列、较小基因的合成。 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列. 因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。 为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。 但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增， 只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。 目的基因的获取 1